【求助】－氯霉素和己烯雌酚的检测方法

那你们有什么仪器?液相或液质有吗?

对这两种物质，电泳也行啊。

ELISA法筛选，液质联用法定量，又快又准

我们有液相和紫外。想找能用上这两种仪器的标准。

水产品中己烯雌酚残留量的测定
酶联免疫法

1 范围
本标准规定了水产品中己烯雌酚残留量的酶联免疫测定方法。
本标准适用于水产品肌肉中己烯雌酚的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。
3 原理
测定的基础是竞争性酶联免疫抗原抗体反应，所有的免疫反应都在微孔中进行，加入己烯雌酚标准或样品溶液、己烯雌酚酶标记物、己烯雌酚抗体后，己烯雌酚与己烯雌酚酶标记物相互竞争己烯雌酚抗体的结合位点。结合的己烯雌酚酶标记物可以将无色的发色剂转化为蓝色的产物，在450nm处检测，吸收光强度与样品中的己烯雌酚浓度成反比，按校正曲线定量。
4 试剂和材料
本标准所用试剂除标明外，其它均为分析纯及其更高纯度，试验用水符合GB/T 6682一级水标准。
4.1 叔丁基甲基醚，色谱纯。
4.2 石油醚。
4.3 二氯甲烷。
4.4　甲醇，色谱纯。
4.5　氢氧化钠，1 mol/L。
4.6 磷酸，6 mol/L。
4.7　20%甲醇的20mmol/L三羟基甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（pH 8.5）, 40%、70%、 80%的甲醇溶液，此溶液现用现配。
4.8 67 mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.2) ： 9.61g磷酸氢二钠,1.79g 磷酸二氢钠溶解于蒸溜水，定容至1000mL，此溶液现用现配。
4.9 己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒, 参见附录A。
5 仪器与设备
5.1 酶标仪,波长450nm。
5.2 离心机，转速4000r/min。
5.3 氮吹仪。
5.4 电热恒温水浴锅。
5.5 高速匀浆机。
5.6 C18 固相提取柱，长6.5cm，内径0.7cm。
5.7 固相萃取器。
5.8 微型漩涡混合仪。
5.9 振荡器。
5.10 微量加样器：20μL, 50μL, 100μL, 250μL，1000μL。
5.11 微量多通道加样器：50μL, 100μL。
6 样品处理
6.1 试样提取
取出鱼、虾、蟹、鳖等水产品肌肉部分，除净脂肪和结缔组织，样品切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混匀，置冰箱中冷冻备用。
将样品解冻，取5g(精确到0.01g)样品于匀浆机的玻璃管中, 加10mL 67 mmol/L 磷酸缓冲液(pH 7.2),充分匀浆, 称取3 g(精确到0.01g)匀浆组织于20mL玻璃离心管中, 加入8mL 叔丁基甲基醚, 强烈振荡20min，4 000 r/min离心10min，转移出上清液至20mL玻璃离心管中，再用8mL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物，将两次提取的醚相合并，70℃水浴蒸发至干。
取70%的甲醇1mL溶解干燥的残留物，加3mL石油醚洗涤甲醇溶液，漩涡混合１min, 4 000r/min离心1min，吸除石油醚，置水浴锅中蒸发甲醇溶液，用1mL二氯甲烷溶解, 加1 mol/L氢氧化钠溶液3mL, 漩涡振荡后静置，取出上层氢氧化钠溶液, 加入6 mol/L 磷酸300μL中和提取液, 用C18 固相提取柱进一步纯化。
6.2 样品纯化
将 C18固相提取柱垂直固定，用3mL无水甲醇洗涤柱子，再用2mL 20%甲醇的20mmol/L Tris缓冲液（pH 8.5）平衡柱子，紧接着将上述用磷酸中和后的氢氧化钠提取液用1000μL微量加样器全部加入柱中，过柱，然后用2mL 20%甲醇的20mmol/L Tris缓冲液（pH 8.5）洗涤柱子，接着用3mL 40%的甲醇洗涤柱子，弃去过柱的溶液，用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹2 min以干燥柱子。
用2mL 80%的甲醇洗脱样品（以上溶液洗柱、平衡柱和提取液过柱的流速皆为１滴/s左右，可用固相萃取器抽真空控制），收集洗脱液，向洗脱液中加入2mL水，取20μL进行酶联免疫测定。
7    酶联免疫测定
检查试剂盒中所有试剂是否齐全完好（参见附录A）。控制室温至20℃～24℃,取出足够数量的微孔条插入微孔架中, 加入20μL的标准液和处理好的样品到各自的微孔底部, 记录各标准液和样品的位置, 标准和样品做两个平行实验。每个微孔中加入50μL稀释后的己烯雌酚抗体，微旋振荡混合,置 2℃～8℃冰箱中孵育20h。
取出微孔架，回复到室温20℃～24℃，洗板(甩出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上每行拍打3次,以保证完全除去孔中的液体。用250μL蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体,再重复操作两次),加入50μL 稀释的酶标记物到微孔底部，微旋振荡充分混合后，置室温孵育1 h，再洗板后(同上述洗板方法)，每个微孔中加入50μL基质和50μL发色试剂, 充分混合，并在室温暗处孵育30min，每个微孔中再加入100μL反应停止液，混合后在60 min内测量并记录每个微孔450nm处的吸光度值。
８　结果计算
8.1 计算相对吸光度值
计算每个己烯雌酚标准液和样液的平均吸光度值，按公式(1)求出己烯雌酚标准液和样液的相对吸光度值：
　　　　　　　　　　　　　Ri=Ai/A0×100　－――――――――――――――――――(1)
式中：
Ri－相对吸光度值，％；
A0－空白标准的吸光度值；
Ai－标准或样品的平均吸光度值。
8.2 绘制校正曲线
以计算的标准液相对吸光度值为纵坐标，以己烯雌酚浓度的对数为横坐标，绘制出己烯雌酚标准液相对吸光度值与己烯雌酚浓度的校正曲线(参见附录B)，校正曲线在0.05~0.4μg/L范围内应当成为线性，相对应每一个样品的己烯雌酚浓度可以从校正曲线上读出。每次试验均应重新绘制校正曲线。
8.3 结果计算
在8.2 条绘制的校正曲线上读出的相对应每一个样品的己烯雌酚浓度乘以相对应的稀释系数（本标准所采用的稀释系数为４），即为试样中的己烯雌酚残留量。
9　检测限、回收率
９.1 检测限
本方法的检测限为0.6μg/kg。
９.2 回收率
　　本方法的回收率≥70%。





























附录A
（资料性附录）
己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒

A.1 己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒
己烯雌酚测定试剂盒由德国R-Biopharm公司制造1)，可用于测定肌肉，尿,　胆汁，粪便及肝脏中的己烯雌酚残留检测。试剂盒应保存在2℃ ～8℃的干燥避光环境中，并在有效期内使用, 试剂变质应当弃掉2)。所有试剂应达到室温20℃～24℃后使用。每个试剂盒包括：
1×框架，96孔板（12条×8孔）包被有兔抗己烯雌酚的抗体(兔IgG抗体)。
6×标准液（1.3mL/瓶）， 为40%的己烯雌酚甲醇水溶液：0 μg/L，0.025 μg/L, 0.05μg/L, 0.1 μg/L, 0.2 μg/L ，0.4 μg/L。
1×己烯雌酚过氧化物酶标记物浓缩液(0.7mL)。
1×己烯雌酚抗体浓缩液(0.7mL)。
1×酶基质(7mL)：含有过氧化脲。
1×发色剂(7mL)：四甲基联苯胺。
1×反应停止液(14mL)：1mol/L硫酸。
1×缓冲液(25mL)。
A.2 己烯雌酚酶标记物的稀释
用试剂盒提供的缓冲液以1: 11的比例，在玻璃试管中稀释酶标记物浓缩液，轻轻地振摇，充分混匀后使用。（由于稀释的酶标记物稳定性不好, 所以只稀释实际需用量的酶标记物）。
A.3己烯雌酚抗体的稀释
用试剂盒提供的缓冲液以1: 11的比例，在玻璃试管中稀释抗体浓缩液，轻轻地振摇，充分混匀后使用。（由于稀释的抗体稳定性不好, 所以只稀释实际需用量的抗体）。

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注：
1)    德国R-Biopharm公司生产的己烯雌酚测定试剂盒是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不排除运用同等性能的其它产品。
2)    发色试剂有任何颜色表明发色剂已变质；空白标准的吸光度值小于0.6个单位（A450nm＜0.6）时，表示试剂可能变质。















附录B
（资料性附录）
己烯雌酚的标准曲线




图B.1　己烯雌酚的标准曲线




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水产品中氯霉素残留量的测定 气相色谱法
1　范围
本标准规定了水产品中氯霉素残留量的气相色谱测定方法。
本标准适用于水产品可食部分中氯霉素残留量的检测。
2　规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3　原理
样品经乙酸乙酯提取并浓缩，提取物溶于水，用正己烷脱脂，C18固相萃取柱净化，硅烷化试剂衍生化后，用配有电子捕获检测器的气相色谱仪测定，外标法定量。
4　试剂
所有试剂在氯霉素出峰处应无干扰峰，最好选择优级纯或色谱纯试剂。
4.1　氯霉素标准品：纯度≥99%。
4.2　甲醇：色谱纯。
4.3　乙酸乙酯：色谱纯。
4.4　正己烷：优级纯。
4.5　氯仿：分析纯。
4.6　乙腈：色谱纯。
4.7　无水硫酸钠：分析纯，650℃灼烧4h，冷却后贮于密闭容器中备用。
4.8　氯化钠：分析纯。
4.9　4%氯化钠溶液：称取氯化钠20g，加水溶解，稀释到500mL。
4.10　氯霉素标准溶液：准确称取氯霉素标准品0.0250g，用甲醇溶解并定容至50mL，配成浓度为500μg/mL的标准贮备液，置4℃冰箱中保存，保存期不超过3个月。临用前，取此储备液，用甲醇稀释成浓度为0.100μg/mL的标准工作液。
注意：通常的玻璃器皿洗涤程序对于从玻璃表面除去痕量氯霉素不总是很有效的，建议使用甲醇淋洗所有玻璃器皿，以避免污染问题。
4.11　衍生化试剂：N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺(BSTFA)/三甲基氯硅烷(TMCS)体积比99∶1。
4.12　水
实验用水应符合GB/T 6682中一级水标准。
5　仪器
实验室常规仪器、设备及下列各项。
5.1　气相色谱仪：配63Ni电子捕获检测器。
5.2　电子天平：感量0.0001g。
5.3　均质机。
5.4　离心机。
5.5　旋涡混合器。
5.6　电热恒温水浴锅。
5.7　旋转蒸发器。
5.8　鸡心瓶：50mL 、100mL，细口。
5.9　玻璃离心管：50mL。
5.10　刻度离心管：5mL，具塞。
5.11　氮吹仪。
5.12　C18固相萃取柱，填料300mg。
5.13　SPE固相萃取装置。
5.14　无水硫酸钠柱：砂芯玻璃层析柱中装无水硫酸钠5g。
6　色谱条件
6.1　色谱柱：DB-5石英毛细管柱，固定相：SE-54（聚甲基苯基乙烯基硅氧烷），30m×0.53mm×0.5μm；或与之相当的色谱柱。
6.2　载气：氮气，线速度29cm/s。
6.3　进样口温度：260℃。
6.4　温度程序：初始柱温150℃，维持1min，15℃/min升至260℃，维持10min或直到氯霉素已经流出，然后设定30℃/min升至280℃，维持5min以确保所有的样品已经流出。
6.5　检测器温度：300℃。
6.6　进样方式及进样量：无分流方式进样，1μL。
6.7　检测器：63Ni电子捕获检测器。
7　测定步骤
7.1　样品预处理
鱼去鳞、去皮沿背脊取肌肉；虾去头、去壳、去附肢，取可食肌肉部分；蟹、中华鳖等取可食肌肉部分；样品切为不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混匀，放置冰箱中冷冻贮存备用。
7.2　提取
将样品解冻，称取样品5g(精确到0.001g)，置于50mL玻璃离心管中，加入乙酸乙酯20mL，均质机均质1min，分散均匀，提取氯霉素，4000r/min离心3min，将乙酸乙酯层转移到100mL细口鸡心瓶中。再向离心管中加乙酸乙酯10ml，用原均质机均质混合1min，4000r/min离心3min，合并乙酸乙酯提取液于100mL细口鸡心瓶中，于40℃水浴中减压旋转蒸发至干。
注：均质机清洗方法，先用大量水浸洗，再用甲醇浸洗，最后用蒸馏水浸洗。
7.3　脱脂净化
向鸡心瓶中加1mL甲醇旋涡混合溶解残留物，再加入15ml正己烷和25mL 4%氯化钠溶液，盖塞振荡混合1min，充分混合提取脂肪，转移到另一50mL离心管中，4000r/min的速度离心2min，除去上层正己烷相并弃去。再向水相中加10mL正己烷，重复提取一遍，弃去正己烷相。
水相中加入15mL乙酸乙酯，旋涡混合器混合2min，3000r/min离心3min，吸取乙酸乙酯层，经过无水硫酸钠柱脱水过滤于50mL鸡心瓶中。再向水相中加入5mL乙酸乙酯，重复上述操作。用少量乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠柱，合并提取液于50mL鸡心瓶中，在40℃水浴中减压旋转蒸发至干。对于大部分样品，到此步骤净化效果已可达到要求，对于净化不完全的样品可经C18固相萃取柱进一步净化。
加入2mL乙酸乙酯溶解提取物并转移于5mL具塞离心管中，用1mL乙酸乙酯洗涤鸡心瓶，合并乙酸乙酯，于50～55℃的砂浴中吹氮蒸发至近干，再用1mL乙酸乙酯洗涤离心管壁并吹干。注意防潮。
7.4　C18柱净化
注意：以下步骤必须连续做完，切莫让吸附剂变干。
给每个样品准备一根C1８柱，顺序用5mL甲醇、5mL氯仿、5mL甲醇和5mL水淋洗活化C18柱，弃掉洗涤液。用5mL5％（V/V）的乙腈水溶液溶解7.3中在40℃水浴中减压旋转蒸发至干的提取物，吸取水溶液装入C18柱过柱，弃掉流出液。注意流速保持每秒一滴，否则净化效果和回收率都较差。用1mL水淋洗鸡心瓶2遍，并将淋洗液加入C18柱过柱，弃掉流出液。用5mL水淋洗C18柱，让洗涤液完全流出C18柱，用微氮吹干。用乙腈将C18柱中的氯霉素洗脱，洗脱2次，每次1.5mL，合并洗脱液于5mL具塞离心管中。在温度50～55℃的砂浴中，用氮气吹除乙腈至近干，再用1mL乙腈洗涤离心管壁并用氮气吹干。注意防潮。
7.5　衍生化
7.5.1 试样的衍生化
向干的残留物中加100μL 衍生化试剂，盖塞并旋涡混合10s，在70℃烘箱中反应30min。再在50～55℃砂浴中，用氮气流吹除多余的试剂，至样品管刚好吹干为止（注意：此步过长的吹干时间可导致丢失分析物）。加入0.5mL正已烷，旋涡混合10s，供气相色谱分析用。
7.5.2 标准工作液的衍生化
取适量标准工作液于5mL具塞离心管中，在温度50～55℃的砂浴中，用氮气吹除溶剂至干。以下按7.5.1的步骤操作。
7.6　样品测定
分别注入1μL适当浓度的氯霉素标准硅烷化衍生物溶液及样品提取物硅烷化衍生物溶液于气相色谱仪中，按上述色谱条件进行色谱分析，记录峰面积，响应值均应在仪器检测的线性范围之内。根据标准样品的保留时间定性，外标法定量。
7.7　计算
样品中氯霉素的含量按公式⑴计算。
⑴
式⑴中： ——样品中氯霉素含量，μg/kg；
S——标准衍生物溶液相当氯霉素含量，ng/mL；
——试样液中氯霉素衍生物的峰面积或峰高；μV·s 或 mm；
——样品提取物衍生化溶液体积，mL；
As——氯霉素标准衍生物的峰面积或峰高；μV·s 或 mm；
m ——样品质量，g。
注：计算结果需扣除空白值。
8　方法回收率
标准添加浓度为0.1～20.0μg/kg时，回收率≥70%。
9　方法检测限
本方法检测限：0.3μg/kg。
10　允许差
两次平行测定结果相对偏差≤15%
11　方法的线性范围
本方法的线性范围：标准衍生物溶液相当氯霉素浓度为 0.5ng/mL～250ng/mL之间。

水产品中呋喃唑酮残留量的测定 高效液相色谱法

1　范围
本标准规定了水产品中呋喃唑酮残留量的测定方法──高效液相色谱法。
本标准适用于水产品可食部分中呋喃唑酮残留量的测定。
2　规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法
3　原理
样品中呋喃唑酮用二氯甲烷提取，蒸发浓缩提取液，无水硫酸钠去除水分，用正己烷液-液萃取除去脂肪及其它杂质，离心，取下层清液经膜过滤器后用高效液相色谱仪分离，紫外检测器检测，外标法定量。
4　试剂和材料
4.1 乙腈：色谱纯。
4.2 二氯甲烷：色谱纯。
4.3 正己烷：分析纯，用乙腈饱和。
4.4 85%磷酸：分析纯。
4.5 乙腈水溶液：乙腈+水（体积分数为80+20）。
4.6 无水硫酸钠：分析纯；经640℃灼烧4.0h后，贮于密闭容器中备用。
4.7 无水硫酸钠柱：200mm×24mm（id），内装50mm~100mm高的无水硫酸钠。
4.8 呋喃唑酮标准品：纯度≥99.5%。
4.9 呋喃唑酮标准储备液：称取10.0mg呋喃唑酮，用乙腈水溶液溶解并稀释定容至50mL棕色容量瓶中，在冰箱中冷藏保存，保存期一个月。该液1mL相当于200µg呋喃唑酮。
4.10 试验用水：符合GB/T 6682一级水标准。

5    仪器和设备
5.1 高效液相色谱仪，配有紫外检测器。
5.2 高速组织捣碎机。
5.3 旋转蒸发仪。
5.3 离心机。
5.4 振荡器。
5.5 蒸发烧瓶，具塞。
5.6 刻度离心管。
5.7 膜孔滤器：0.45µm。

6 色谱条件
6.1 色谱柱：C18柱, 250mm×4.6mm（id），粒度5µm。
6.2 流动相：乙腈+水+磷酸（体积分数为40+60+0.1）。
6.3 流速：0.8mL/min。
6.4 检测波长：365nm。
6.5 柱温：室温。
6.6 进样量：20µL。
7 样品测定
7.1 试样制备
取鱼、虾、蟹、鳖等水产品可食部分，切成不大于5mm×5mm×5mm的小块后混匀，经高速组织捣碎机捣碎即可，充分混匀。
7.2 提取
称取捣碎样品约10g（精确至0.01g），加25mL二氯甲烷搅拌分散后浸泡15min，在振荡器上振荡5min，提取液经无水硫酸钠柱滤入蒸发烧瓶中，残渣分别用25mL和15mL二氯甲烷按上述方法各重复提取一次，再用15mL二氯甲烷冲洗无水硫酸钠柱，并采用洗耳球吹出柱中液体，滤液均滤入同一蒸发烧瓶中，滤液于旋转蒸发仪上在45℃左右水浴下减压蒸发去除溶剂，蒸发速度控制在每秒一滴。
7.3 净化
用1.0mL流动相和1.0mL正己烷溶解残渣并充分洗涤蒸发烧瓶，将液体移入离心管中，在4000r/min离心5min，用尖嘴吸管移去上层正己烷层，再向离心管中加入1.0mL正己烷，混匀2min，离心，用尖嘴吸管移去上层正己烷层，下层清液经0.45µm膜孔滤器过滤后进HPLC分析。
7.4 测定
7.4.1 呋喃唑酮标准工作液配制
临用前，取呋喃唑酮标准储备液，用流动相稀释成浓度为0.01µg/mL~1.00µg/mL的标准工作液。
7.4.2 液相色谱测定
根据样品液中呋喃唑酮残留量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样品液中呋喃唑酮响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品液等体积参插进样进行测定。在上述色谱条件下，呋喃唑酮保留时间约为5.8min。
7.5 空白试验
除不加试样外，按7.2~7.4步骤进行。
8    结果计算与表述
根据标准工作液和样品液的峰高，按式（1）计算样品中呋喃唑酮残留量：

（h-h0）×V×1000
C=Cs × ···································（1）
hs×m
式中：
C──样品中呋喃唑酮残留量，单位为微克每千克（µg/kg）；
h──样品液中呋喃唑酮的峰高；
hs──标准工作溶液中呋喃唑酮的峰高；
h0──空白试验的峰高；
Cs──标准工作溶液中呋喃唑酮的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；
V──样品液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
m──样品的称取量，单位为克（g）。
9    线性范围、检测限、回收率
9.1 线性范围
本方法的呋喃唑酮标准工作液线性范围为0.01µg/mL ~1.00µg/mL。
9.2 检测限
本方法的检测限为1µg/kg。
9.3 回收率
本方法回收率为72.8%~96.2%。





































附录 A
(资料性附录)
呋喃唑酮高效液相色谱图






图A.1 呋喃唑酮标准品色谱图


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