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【分享】touch down PCR

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2010/09/17

Touchdown PCR是指每隔一个循环降低1°C反应退火温度，直至达到“Touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。该方法最初出现是为了避开确定最佳退火温度而进行的复杂的反应优化过程。正确和非正确退火温度之间的任何差异将造成每个循环PCR产物量的两倍差异（每摄氏度造成4倍差异）。因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。该方法的另一个应用是在确定已知序列肽的DNA序列。具体过程如下：使用两套与已知序列肽两末端可能配对的简并引物，这只需要知道一段长为13个氨基酸的肽段序列，5’和3’引物各长18个碱基（6个氨基酸），两者之间有一个碱基以上的间隔。使用简并引物即可以进行“Touchdown PCR”。由这种方法将获得大量的产物，但因为由肽序列可以知道引物之间的确切距离，所以可以根据产物的大小来选择所需要的产物。该方法的优点在于可以富集引物与模板正确配对的产物。如果克隆和测需一打PCR产物，将可以确定肽的正确编码序列，设计进行杂交的寡核苷酸等。该技术特别适用于由Ser，Lys和Arg（每个有6个密码子）构成的多肽。用primer premier来计算引物Tm值，退火温度设计为从Tm+5度降落至Tm-10度，每度2个cycle，最后在tm-10度上增加5-10个cycle.例：Tm为58度，则从63度降落到48度，每度2个cycles,最后在48度加5-10个cycles. 　　原理就在于，温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严谨性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率（此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争）。　　但是，退火温度TOUCH DOWN无法改善扩增效率低的问题，一般用于在杂模板中提高扩增特异性。　　降落PCR（touch down PCR）：指的是每一个（或n个）循环退火温度逐步降低1度，直到达到一个较低的退火温度，该温度称为：“touchdown"退火温度，然后在该温度下继续循环10个左右循环。　　退火温度的起始温度高于计算的Tm15度左右（我觉得高于10度也可），在接下来的循环中，退火温度每个循环降低1－2度（一般为1度），直到低于Tm5度。　　该策略的目的在于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即特异行扩增的反应物之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异产物在此时已经有一个几何数的起始优势，在剩余的反应中，特异产物会竞争非特异产物，特异产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。　　该方法主要用于避免非特异性PCR产物的出现，尤其是当使用复杂的基因组DNA模板，非特异性退火易发生时。　　例子：　　94度预变性3分钟，　　94度变性30秒，65度（Tm若为55度）退火30秒，72度延伸1分钟。　　以后每个循环依次降低1度，直到50度，共15个循环。　　94度变性30秒，50度退火30秒，72度延伸1分钟。15－20个循环。　　72度延伸10分钟。

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