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【第三届原创参赛】利用高效液相色谱检测偶氮染料相关实验

xiaopang

2010/09/19

私聊

液相色谱（LC）

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来参加原创大赛自己手头没有啥好来参赛捧场的~~~但是恰好朋友这里有一些整理的小东西，于是分享出来，代她参赛了~~~~本文实验还不完整，只是实验的部分内容整理，为的是能与大家交流抛砖引玉！

利用高效液相色谱检测偶氮染料相关实验

1．试验目的

纺织品偶氮染料中可还原出的芳香胺对人体或动物有潜在的致癌性，起致癌作用的过程包括纺织品上的这类偶氮染料在与皮肤的长期接触中，在某些特殊的条件下特别是在染色牢度不佳时，会从纺织品上转移到人的皮肤上，在人体正常代谢过程分泌物的生物催化作用下发生分解还原，并释放出某些有致癌性的芳香胺，这些芳香胺被人体皮肤吸收后，在体内通过代谢作用而使细胞的脱氧核糖核酸（DNA）发生变化，成为人体病变的诱发因素，具有潜在的致癌致敏性。同时，脱落的染料本身通过人体皮肤吸收后，其还原过程亦可在人体内部发生，造成同样的致癌致敏性。目前，公布的列入禁用之列的疑致癌芳香胺包括联苯胺等20种对动物有致癌性的物质。

根据国家推荐性标准GB/T17592-2006,偶氮染料可以用GC/MS进行定性定量分析，气相色谱法具有选择性高，分离效率高，分析速度快等特点。但是由于样品基体多样, 杂质成分繁多, 在检测时杂质无法与待测组分分开。此外在禁用之列的芳香胺与其同分异构体(不在禁用之列的芳香胺) 的分子量相同, 极性相似, 沸点相当而严重干扰分离测定, 并由此可能产生错误的定性结果, 即假阳性结果。而高效液相色谱法分离度高，检测灵敏度高，分离效能好，与之共用却恰可弥补这一不足之处。本实验主要研究利用液相鉴别芳香胺，对其进行定性定量分析及其相关内容。下表为气相色谱法和高效液相色谱法的比较。

2．高效液相色谱法简介

色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，从20世纪初俄国植物学家茨维特（M.S.Tswett）提出经典液相色谱法后，色谱分析法取得迅速发展。作为色谱分析法的一个分支，高效液相色谱法是在20世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的新兴分离分析技术。，它采用了新型高压输液泵，高灵敏度检测器和高效微利固定相，流动相通过高压输液泵进入高柱亚的色谱住，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。

3．仪器检测步骤及注意事项

首先，对仪器参数进行合理的设置。包括：设置自动进样器的进样量，洗针程序；设置泵流量，程序梯度表以及检测时间；设置色谱柱两侧的温度；设置监测器需要检测的波长，选择所用的灯光。

接着，编辑样品方法，准备样品，然后用高效液相色谱仪进行检测。然后调入混标数据进行标准的设定，根据标准对其进行定性定量。

注意事项：开机时和关机前要先用100%甲醇冲洗干净，并确保管路里没有气泡。仪器要稳定30分钟，保证基线基本平稳时才能开始检测样品。若基线不稳定或峰形不好可能是因为流动相不纯净，或者色谱柱受到污染需要清洗；使用的水一定是二级或二级以上的纯净水。

4．检测偶氮染料的检测定性实验

4.1 实验前处理方法：取有代表性试样剪成5mm*5mm的小片，混合。从混合样中称取1g至于反应器中，加入16ml预热到70±2度的柠檬酸盐缓冲溶液，将反应器密闭，用力振摇，使所有试样浸于液体中，置于70±2度的水浴中，并在保温30分钟，使所有的织物充分浸湿。然后，打开反应器，加入3ml连二亚硫酸钠溶液，并立即密闭振摇，将反应器再于70±2度的水浴中保温30min,取出后2min内冷却到室温。

用固液萃取柱萃取芳香胺化合物，用乙醚进行洗提，在置于真空旋转蒸发仪上将其浓缩至1ml，再用缓氮气流驱除乙醚溶液，使其浓缩至尽干。再用2ml乙氰定容，用高效液相色谱仪进行分析。

4.2 检测条件：

A)色谱柱：agilent C₁₈,250mm*4.6mm1 ；

B)流量：1.0ml/min；

C)柱温：30℃；

D)进样量：15.0μL；

E)检测器：二极管阵列检测器（DAD）；

F)检测波长：240mm，280mm，305mm；

G)流动相A：甲醇；

H)流动相B：0.575g磷酸二氢铵+0.7g磷酸氢二钠溶于1000ml二级水中；

I)梯度见下表，混合标准物质色谱图见下图：

注1：实验中发现在流动相纯净的情况下，色谱峰基线不太稳定，怀疑是长时间使用色谱柱使其内部存留下流动相杂质，出现鬼峰。所以尝试更换色谱柱。发现基线较以前稳定。

注2：由于本试验中所采用的液相色谱柱与标准中推荐色谱柱不同，导致采用标准中推荐梯度无法将21种芳香胺化合物的色谱峰分开，所以本试验通过改变液相的梯度淋洗程序来达到21种化合物峰的完全分离。

A)色谱柱：ODB C₁₈（5mm）,250mm*4.6mm ,或相当者

B)流量：1.0ml/min

C)柱温：30℃

D)进样量：15.0μL

E)检测器：二极管阵列检测器（DAD）
F)检测波长：240mm，280mm，305mm;

G)流动相A：甲醇；

H)流动相B：0.575g磷酸二氢铵+0.7g磷酸氢二钠+100ml甲醇溶于1000ml二级水中，PH=6.9

I)梯度见下表，混合标准物质色谱图见下图

由色谱图看出，色谱峰基本分开，有20个左右明显的色谱峰出现。所以假设此色谱图可以用作定性分析。

2. 配置一定浓度单一标准物质，在相同的仪器设置参数下，用液相对其进行检测，根据保留时间确定混表中色谱峰所代表的标准物质。

在该条件下，邻氨基偶氮甲苯被还原成邻甲基苯胺， 2-氨基-4-硝基甲苯被还原为2，4-二甲基苯胺，故实际分析中仅需测定表中的21种芳香胺。

由试验结果看出，在标准方法测定条件下，有两对物质的色谱峰对应在混和标准物质的色谱图中不能被分开，它们分别是3，3`-二甲基联苯胺（31.484min）, 3，3’-二甲氧基联苯胺(31.643min)与邻甲苯胺（31.513min）；2，6-二甲基苯胺（26.813min）与2-甲氧基-5-甲基苯胺（26.556min）。故此方法不宜直接使用。

在高效液相色谱检测中，通常我们改变液相色谱的进样量，泵流量，柱温，梯度淋洗程序，检测的波长，所用的灯等仪器参数来达到优化色谱图，达到较高分离度的要求。这些仪器参数对检测效果以及色谱图的质量都有一定的影响。

3. 改变仪器参数提高混标的分离度

A 改变流量

分析色谱峰没有分离开的原因，怀疑是流量太大，将化合物同时从色谱柱内洗提出来，于是减小流量到0.7ml/min。然后对混标进行检测。色谱图如下：

由色谱图中看出，将流量减小后色谱峰的流出时间整体延后了，因为流量降低加长了流动相在管内停留的时间，但是色谱峰的数量并没有增多，芳香胺化合物也没有得到完全的分离。

B 改变柱温

将柱温箱的温度降低到25℃时对混和标准物质进行检测。

降低柱温同样使得保留时间拖后，并且在35.008min出现了一个新的色谱峰（在标准进样中，在240nm处，此色谱峰与其前面的大峰被认为是一个峰，并合并起来积分了）。但是，降低温度也没有使芳香胺化合物得到完全的分离。

C 改变梯度洗提程序和更换色谱柱

一般情况下，如果色谱峰的分离度不好，不能完全分离化合物，最常用的方法是改变梯度洗提程序程序和更换色谱柱来分离之前分不开的化合物。

在标准进样的混标色谱图上，根据它的处分时间和梯度洗提程序，可以推算出2，6-二甲基苯胺（26.813min）与2-甲氧基-5-甲基苯胺（26.556min）出现色谱峰时流动相B的百分浓度大约在68.5%，则A的百分浓度大约在31.5%左右；3，3`-二甲基联苯胺（31.484min）, 3，3’-二甲氧基联苯胺(31.643min)与邻甲苯胺（31.513min）出现色谱峰时B的百分浓度在55%左右，而且大多数得色谱峰时出现在B的百分浓度从60%-50%这一范围内，于是，在用高效液相色谱检测混合标准溶液时，梯度洗提程序中可以增加这两段浓度的停留时间，也可以减缓它在该浓度附近的变化率，使这两个化合物有充分的时间在该浓度下一次被洗提出来。

此方法得到的色谱图分离度较高，且将21种芳香胺化合物基本分离开来（有几个峰形不是很好的，但是可以辨认出来，不会对化合物的确认有影响）。

接着，根据此方法把配置好的一定浓度单一标准物质，在相同的仪器设置参数下，用液相对其进行检测，根据保留时间确定混表中色谱峰所代表的标准物质并进行定量分析，这便是后话了！！

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