【转帖】水产品中螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素与北里霉素残留量的超高效液相色谱一紫外检测法同时测定

螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、北里霉素均属于大环内酯类抗生素，大环内酯类药物主要用于畜禽，对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌、霉形体、螺旋体等均有抑制作用。近年来，大环内酯类药物在水产养殖中的新应用13益受到关注。王秀珍等⋯报道了北里霉素与对照药物泰乐菌素防治草鱼“三病”的研究。随着研究的深入，替米考星等大环内酯类药物对人体的危害也逐渐被人们所认识，如大环内酯可产生交叉耐药性，高残留会对人类造成致敏性和毒副反应，尤其是敏感个体等。1999年以来，欧盟禁止将泰乐菌素与螺旋霉素作为促生长剂添加到动物饲料中 。我国农业部颁布的NY5071—2002《无公害食品、渔药使用准则》中规定禁止泰乐菌素在水产养殖中使用。我国和欧盟还规定了动物组织中螺旋霉素、替米考星、北里霉素和泰乐菌素的最高残留量 。目前，动物组织和牛奶中大环内酯类药物残留的测定多采用液相色谱一质谱法 ，而测定水产品中该类药物的报道较少。Horie等 采用液相色谱电喷雾质谱法测定水产品中的大环内酯类药物，也有报道采用高效液相色谱一串联质谱法测定水产品中红霉素¨ 、鳗鱼中大环内酯类残留 、鱼肉中林可酰胺类和大环内酯类抗生素残留 ，以及液相色谱法同时测定水产品中螺旋霉素和泰乐菌素 。而水产品中螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素和北里霉素同时测定的液相色谱和超高效液相色谱法尚未见报道。超高效液相色谱法由于具有分析速度快、灵敏度高等优点而得到广泛应用¨ 。本文首次采用超高效液相色谱一紫外检测法(UPLC—TUV)建立了同时测定水产品中螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素和北里霉素的分析方法。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC超高效液相色谱(美国Waters公司)配TUV双通道紫外检测器及Empower 2色谱工

作站；Mettler—Toledo AE-240型精密电子天平(瑞士梅特勒一托利多公司)；20PR-520型自动高速冷冻离心机(日本日立公司)；FS一1高速匀浆机(常州华普达教学仪器有限公司)；调速混匀器(上海康华生化仪器制造厂)；HGC．12氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；RE一2000E旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限责任公司)；固相萃取装置(德国CNW公司)；Oasis HLB固相萃取柱(3 mL／60 mg，Waters公司)。

替米考星标准品(纯度不低于98％)、泰乐菌素标准品(纯度不低于99％)、北里霉素标准品(纯度

不低于72％)、螺旋霉素标准品(纯度96％)均购自Dr．Ehrenstorfer GmbH公司，乙酸乙酯、正己烷、乙腈、甲醇(色谱纯，美国J．T．Baker公司)；磷酸二氢铵(天津大茂化学试剂厂)、磷酸二氢钠(天

津福晨化学试剂厂)、氯化钠(天津东丽区天大化学试剂厂)、酸性氧化铝(上海五四化学试剂有限公司)、乙醚(上海马陆制药厂)均为分析纯；磷酸(优级纯，天津光复精细化工研究所)；鲫鱼由市场购买，南美白对虾肌肉样品为送检样品。

1．2 实验方法

1．2．1 样品处理鱼洗净去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；虾洗净去头、去壳，取肌肉部分；甲鱼等取食用部分；样品均质混匀于一18℃冰箱中保存，备用。

测定时，将匀浆冷冻保存的肌肉样品于室温下自然解冻。准确称取10．0 g样品置于50 mL离心管

中，加入30 mL乙腈，涡旋振荡混匀1 min，4 500 r／min离心10 min，取上清液置于鸡心瓶中。向残渣中再加入15 mL乙腈重复提取1次，合并提取液于鸡心瓶中，置旋转蒸发仪浓缩至近干，加入5 mL4％ NaC1溶液溶解残渣，涡旋振荡混匀30 s，再加入5 mL正己烷，涡旋振荡混匀1 min，静置5 min，弃去上层正己烷层，重复去脂1次。

1．2．2 样品净化将HLB固相萃取小柱以5 mL乙腈、5 mL水活化后，将水相过固相萃取柱(柱流速

保持1 i$／s)，用10 mL蒸馏水、10 mL 5％ 乙腈水溶液淋洗HLB固相萃取柱，用8 mL乙腈洗脱，洗脱液置50℃氮吹仪上吹干。向残渣中加入1 mL初始条件的流动相定容，涡旋振荡混匀1 min，经0．22um滤头过滤于进样瓶中，UPLC—TUV分析。

1．2．3 标准溶液的配制及标准曲线的制备分别准确称取各标准品0．01 g(精确至0．000 1 g)，用乙腈分别溶解并定容至100 mL，配制成100 mg／L标准储备液，一20 cc冰箱中冷藏。测定时将各标准溶液混合后稀释成0．1、0．2、0．5、1、5、10、15、20 mg／L的混合标准溶液。分别以螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、北里霉素的峰面积(A)为纵坐标，质量浓度(c)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数(r)。

1．2．4 色谱条件ACQUITY UPLC BEH C 8(100 rnm×2．1 mm，1．7 m)反相色谱柱；柱温：45℃ ；流速0．3 mL／min；进样量10 。梯度洗脱条件：A相为乙腈，B相为25 mmol／L磷酸二氢铵溶液(含10％乙腈，pH 2．5)；梯度洗脱程序：0～1．5 min，10％ A；1．5～7．5 min，10％ 50％ A：7．5～8．0min，50％～10％ A；8．0～9．0 min，10％ A；紫外检测方式采用单波长运行模式：0～2．5 min，波长为287 nm，2．5～4．5 min，波长为232 nm，4．5～6．1 min，波长为287 nm，6．1～8．8 min，波长为232nm，8．8～9．0 min，波长为287 nm。

2 结果与讨论

2．1 UPLC法与HPLC法的比较

UPLC系统较HPLC系统具有更细的管路，采用1．7 Ixm粒度的c 色谱柱，具有更小的死体积，更

高的分辨率，分析速度快，流动相消耗更少。刘哗等 报道了猪肝中4种大环内酯类抗生素的高效液

相色谱(二极管阵列检测器)检测法，其分析时间为30 min，流速为1 mL／min；采用UPLC测定4种大

环内酯类抗生素只需9 min将其与杂质峰分开，且流速采用0．3 mL／min可节省溶剂。因此，本文采用的UPLC法既节约了成本又缩短了分析时间。

2．2 样品前处理的优化

由于实验采用1．7 la,m粒度填料的c。 色谱柱，该色谱柱对所分析的样品较高效液相色谱(5 Ixm填料的反相色谱柱)有更大的峰容量和更好的分辨率，所以同等前处理条件下，超高效液相色谱图比高效液相色谱图有更多的杂质峰。考虑杂质峰对色谱基线及目标峰的影响，故采用HLB固相萃取柱净化样品。分别以乙酸乙酯、乙醚、乙酸乙酯一乙醚(体积比1：1)、乙腈、乙酸乙酯一乙腈(体积比1：1)为提取剂进行提取，考察不同提取剂的影响。采用乙酸乙酯和乙醚为提取剂时，先加入0．1 mol／L的磷酸二氢钠(用氨水调节pH 8．0)，且不过固相萃取柱。结果表明，乙酸乙酯较乙醚更适合螺旋霉素和替米考星的提取，而乙醚对泰乐菌素和北里霉素提取回收率较高。分别用乙腈和乙酸乙酯一乙腈作为提取剂时，两者对于4种大环内酯类药物提取回收率高，但采用乙酸乙酯一乙腈作为提取剂在提取药物的同时也提取了样品的中极性和非极性杂质，而采用乙腈作提取剂提取杂质较单一，更有利于HLB固相萃取柱净化。采用乙腈提取，蒸干后加入磷酸二氢铵和4％ NaC1溶液，结果发现采用4％ NaC1溶液溶解的样品，溶液更清澈且更容易通过固相萃取柱。所以实验采用乙腈为提取剂，4％ NaC1溶液溶解，蒸发近干的样品用正己烷去脂，过HLB柱净化。

2．3 定容溶液的选择


实验分别考察了二甲基甲酰胺一磷酸二氢铵、乙腈一磷酸二氢铵(体积比1：1)和乙腈一磷酸二氢铵(1：1，用磷酸调至pH 2．5)作为定容溶液的影响。结果表明，采用乙腈一磷酸二氢铵(1-1)作为定容溶液杂质峰较少。所以，实验采用乙腈一磷酸二氢铵(体积比1：1)作为定容溶剂。

2．4 色谱条件的优化

分别考察了乙腈体积分数均为10％的乙腈一25 mmoL／L磷酸二氢钠、乙腈一25 mmoL／L磷酸二氢钠(用磷酸调pH 2．5)、乙腈一25 mmol／L磷酸二氢铵、乙腈一25 mmol／L磷酸二氢铵(用磷酸调pH 2．5)4种流动相对螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、北里霉素的分离情况。结果表明，在此4种流动相条件下螺旋霉素和替米考星均有较好的峰形，但泰乐菌素和北里霉素峰形较差，以磷酸二氢铵(pH 2．5)为流动相时紫外检测灵敏度较以磷酸二氢钠为流动相的灵敏度高，同时用磷酸调节pH为2．5时色谱柱更易平衡，所以本实验选用乙腈一25 mmol／L磷酸二氢铵(pH 2．5)为流动相，在该流动相条件下，分别研究了柱温为30、40、45、50、60℃时对各药物分离的影响，结果发现随着柱温的升高各药物的保留时间提前，峰形变好，特别是泰乐菌素和北里霉素的峰形更好。但由于高温会缩短色谱柱的寿命，综合考虑各药物峰形、灵敏度和色谱柱寿命，最终选择柱温为45度

楼主你好，最近也在看一下这方面的东西。。。
请教下：提取后蒸干用 4％ NaC1溶液溶解，为什么可以这样？
大环内酯类用乙腈提，说明极性算强的了，用4％ NaC1溶液溶解时什么原理呢

哪位大侠可以解释下啊。。。。

大环内酯类的极性并不强，真真强的是乙腈，乙腈的溶解性能是很好的，多数小分子有机都可以溶解进去，而且去除蛋白的效果又还比较好