【第三届原创参赛】采用HPLC-ELSD测定醒脑再造丸中黄芪甲苷的含量

一、仪器及试药

1. 药品与试剂

黄芪甲苷对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）；醒脑再造丸；乙腈（色谱纯）；其他均为分析纯。

2. 实验仪器

日本岛津LC-10AT VP高效液相色谱仪，ALLTECH ELSD2000型蒸发光散射检测器，SPD-10AT VP型自动进样器

3. 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Gemini C₁₈（200×4.6mm,5µm）；流动相：乙腈- 水（36：64)；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；漂移管温度：105℃；载气流速：2.7L/min；Gain：8；理论板数按黄芪甲苷峰计算不低于4000。

4.样品分析方法

4.1对照品溶液的制备：精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

4.2供试品溶液的制备 取重量差异项下的本品剪碎，取9g，精密称定，加硅藻土8g，研细，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流6小时，提取液回收甲醇并浓缩至干，残渣加水20ml，微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇提取液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，放冷，通过Ｄ101 型大孔吸附树脂柱 (内径1.5cm,长12cm),以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

4.3测定方法：精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。

二、方法与结果

1.提取方法的考察：

①取本品9g，剪碎，精密称定，加70%乙醇100ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，称定重量，加乙醇补足减失重量，滤过，取续滤液25ml，蒸干，加水10ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，用甲醇溶解并转移到5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，进行测定。

②取本品9g，精密称定，加硅藻土8g，研细，加甲醇40ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流6小时，提取液回收甲醇并浓缩至干，残渣加水20ml微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇提取液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，放冷，通过通过Ｄ101 型大孔吸附树脂柱 (内径1.5cm,长12cm),以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，进行测定。

③取本品9g，精密称定，加硅藻土8g，研细，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流6小时，提取液回收甲醇并浓缩至干，残渣加水20ml微热使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇提取液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水10ml使溶解，放冷，通过通过Ｄ101 型大孔吸附树脂柱 (内径1.5cm,长12cm),以水50ml洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，进行测定。

采用上述三种提取方法进行试验，结果见表1。

从上表得出，方法③的分离效果良好，通过D101大孔吸附树脂柱100ml洗脱液后无黄芪甲苷检出, 黄芪甲苷提取比较完全，因此我们采用正文所述的供试品溶液的制备方法。

2.色谱柱的选择及柱效的考察：

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(36：64)为流动相；柱温40℃。

①采用Phenomenex Gemini C₁₈（250×4.6mm,5µm）的色谱柱测定，黄芪甲苷对照品及供试品色谱图。

②采用Phenomenex^R Luna C₁₈（250×4.0mm,5µm）的色谱柱测定，黄芪甲苷对照品及供试品色谱图。

③采用Diamonsil^{TM M} C₁₈（250×4.0mm,5µm）的色谱柱测定，，黄芪甲苷对照品及供试品色谱图。

采用上述三种色谱柱进行试验，结果见表2。

综合考察以上3个流动相比例，乙腈：水（36：64）分离效果良好，黄芪甲苷主峰保留时间适中，峰形好。

4.空白对照试验

为进一步考察试验的合理性，取不含黄芪的空白对照样品，依正文所述方法进行测定。结果显示，空白样品色谱在与黄芪甲苷峰相应的保留时间附近无干扰峰检出。

5.方法学考察

5.1标准曲线制备

精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，分别精密吸取5、10、15、20、25µl测定，以对照品进样量（µg）的自然对数为横坐标，以峰面积的自然对数为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，Y=1.9526x＋13.6286 (r=0.9997)，结果表明黄芪甲苷在0.486-2.43µg范围内，呈线性关系，符合外标对数两点法定量测定的要求。


5.2精密度试验

按正文供试品溶液制备方法制备供试液，精密吸取供试液20µl，注入液相色谱仪，重复6次，测定其色谱峰面积值，RSD为0.92%。


5.3稳定性试验

取供试品溶液，每隔0,2,4,8,12,24h取样，按正文色谱条件测定。计算RSD为1.29%。结果表明24小时内供试品溶液中黄芪甲苷的含量基本稳定。

5.4回收率试验

精密称取已知含量的供试品（含量为 0.4352mg/丸）6份，分别精密加入对照品溶液（0.1067mg/ml）2.0 ml，依法测定，计算回收率，结果见表4。

表4 回收率试验结果

图1黄芪甲苷对照品色谱图 图2供试品色谱图

表5样品及黄芪甲苷的含量测定结果

如表5所示，四批样品含量测定结果显示，根据《中国药典》2005年版一部黄芪的含量测定限度和该处方中黄芪药材的量，得出本品每丸含黄芪甲苷最低不得少于0.24mg，而上述测定结果比较切合实际有三批。因此，暂定本品每丸含黄芪甲苷（C₄₁H₆₈O₁₄）计，不得少于0.24mg。

三、讨论

黄芪为方中君药，故采用测定黄芪甲苷的含量来控制其质量.关于黄芪甲苷的含量测定方法文献报道和载入标准的方法较多, 经薄层色谱法试验，黄芪甲苷与红参、三七中的某一皂苷成分薄层色谱行为一致，故无法采用薄层扫描法进行含量测定。黄芪甲苷只有紫外末端吸收，若采用UV法测含量，黄芪甲苷的浓度很大 难达到分离，而采用甲醇提取，水饱和正丁醇萃取，D101大孔吸附树脂进一步除杂后，再参照《中国药典》2005版一部黄芪项下的含量测定方法（HPLC-ELSD法）测定，该方法重现性好，准确度高。

参考文献

1.《中国药典》2005年版一部：212

2.辛颖，宋晓东，刘哲，张禅那，惠汝太.HPLC-ELSD法测定欣力胶囊中黄芪甲苷的含量.《药物分析杂志》2008，28（4）：602

3.马淑杰.高效液相色谱-蒸发光散射法测定驴胶补血颗粒中黄芪甲苷的含量.时珍国医国药-2007:18(1)-98-99

4.王端统,林巨健,许玉丽等.HPLC-ELSD法测定脑清宁中黄芪甲苷的含量.中华实用医药杂志,2005,11(5):2

文章投哪了？

猪怎么转过来了，我是想问下你的文章投哪个杂志了？
呵呵

不过感觉没什么创新

放在液相吧，支持液相版原创

这个文章是原来做的，没投哪个杂志。就是和大家做个分享。

支持下，不过感觉工作做得太简单了