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【第三届原创参赛:日立L-2000天美公司原创大赛】水果精华咀嚼片中β-胡萝卜素含量的测定

limingzhiqian

2010/10/15

液相色谱（LC）

维权声明：本文为limingzhiqian原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

β—胡萝卜素是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上有显著的功能，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。β—胡萝卜素也可作为一种食用油溶性色素，其本身的颜色因浓度的差异，可涵盖由红色至黄色的所有色系。

1、检测仪器

1) 单光束紫外可见分光光度计，SP-2000UV，上海光谱仪器有限公司

2) 高效液相色谱仪，L-2000，HITACH

①　L-2130输液泵

②　L-2200自动进样器

③　L-2300柱温箱

④　L-2400紫外可见检测器

⑤　EZChrom Elite系统工作站

2、色谱条件

色谱柱：Hitachi LaChrom C18(5μm) 4.6mmI.D.x250mmL

柱温：38℃

检测波长：450nm

流速：1mL/min

进样量：20μL

流动相A：甲醇：乙腈：正己烷：二氯甲烷（15：20：20：20，V/V）

流动相B：甲醇：乙腈（90：10，V/V）

3、溶液配制

标准储备液：准确称取β-胡萝卜素标准品适量于50mL容量瓶中，用三氯甲烷溶解后定容,现用现配，临用前标定其准确浓度。

标准中间液：用移液管吸取1mL标准储备液于25mL容量瓶中，用流动相定容后待用。

标准使用液：分别吸取0.5,1,2,3,5mL标准中间液于5个25mL容量瓶中，用流动相定容。

4、 β-胡萝卜素标准储备液的标定

取β-胡萝卜素标准储备液10.0μl，加正己烷3mL，混匀，以正己烷为空白测吸光度值，波长450nm，平行测定三次，取均值，按下式计算溶液浓度：

标准溶液浓度 =
A×3.01
E×0.01

式中:

X— 胡萝卜素标准溶液浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

A— 吸光度值；

E—β-胡萝卜素在正己烷溶液中，入射光波长450nm，比色杯厚度1cm,溶液浓度为1mg/L的吸光系数，为0.2683；

3.01
—

测定过程中稀释倍数的换算系数。

0.01

5、样品前处理

1）皂化-萃取

1) 样品的皂化：称取样品0.1 g（精确到0.0001克）于250mL皂化瓶中，加无水乙醇30mL，加50%氢氧化钾溶液10mL，边加边摇至上述溶液混匀，将转子放入皂化瓶移至磁力加热搅拌电热套上，使其处于沸腾回流30min后，用乙醇冲洗冷凝管后取下，冷却至约40℃。

2) 样品的提取：转移皂化液于500mL分液漏斗中，用约50mL蒸馏水分3次冲洗皂化瓶，将洗液及残渣并入分液漏斗，用100mL石油醚分3次冲洗皂化瓶，石油醚及残渣并入分液漏斗，用分液漏斗瓶塞密封转移至振荡器上，振摇分液漏斗，280r/min，震摇两次，每次3min，其间要放气，取下分液漏斗，用蒸馏水冲洗瓶塞，用约50mL/次蒸馏水洗分液漏斗中的石油醚层，静置分层，弃去水层，共3次最后要将水层去净。

3) 样品浓缩：将无水硫酸钠放入用棉塞堵好漏斗中，置于150mL平底烧瓶上，收集醚液，用约20mL分2～3次石油醚冲洗分液漏斗，洗液并入烧瓶中，再用约10mL石油醚分三次冲洗无水硫酸钠，洗液并入烧瓶中，水浴 40℃真空抽干，取下加入20mL流动相，滤液过0.45μm滤膜后待用。

2）溶剂萃取

称取0.2g试样于50mL带塞离心管中，用石油醚+丙酮(80+20，V/V)混合液振摇提取，吸取上层黄色液体并转人蒸发器中，重复提取直至提取液无色，合并提取液，于旋转蒸发器上蒸发至干(水浴温度为40℃).

6、实验结果

（1）标准曲线

表1 β-胡萝卜素标准溶液浓度及峰面积
序号
标准浓度（mgmL）

保留时间（min）

峰面积
1
0.33
4.120
640820
2
0.82
4.120
1038747
3
1.64
4.127
1716245
4
3.27
4.113
4345105
5
8.19
4.120
10254220
6
16.37
4.130
17815064

（2）色谱图及含量

（一）样品处理采用皂化-萃取方法，流动相采用A组

（二）样品处理采用皂化-萃取方法，流动相采用B组

（三）样品处理采用溶剂萃取方法，流动相采用B组

表2 不同条件下样品检测结果

条件

水果精华片A(mg/100g)
水果精华片B(mg/100g)
（一）
110
97.7
（二）
37.3
31.3
（三）
未检出
未检出
实际添加量
100
100

7、结论

1.β-胡萝卜素属于脂溶性物质，化学性质不稳定，遇氧、热和光时呈不稳定，因此为了提高其稳定性及改善其溶解性，经常采用糊精、明胶等物质进行包埋处理，因此样品直接采用溶剂提取，不能将其中含有的β-胡萝卜素提取出来；通过皂化后再萃取则可以得到满意的结果；

2.流动相A系统分析时间短，且对β-胡萝卜素有很好的保留，节省流动相；而流动相B系统分析时间较长，同时浪费大量的有机试剂；

3.采用皂化-萃取及流动相A系统方法可以对同类产品：蔬菜精华片以及胶囊中的β-胡萝卜素含量进行定量分析，测量结果与实际添加量均比较吻合。

附件：

水果精华咀嚼片中β-投稿.doc

精
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小不董

第1楼2010/11/08

应助达人

看了楼主的文章有几个问题想咨询下，胡萝卜素是可以很好溶解在氯仿或者正己烷？所以流动相有二氯甲烷，不知为什么要比较流动相B？而且时间延迟了好多，如果说减少一种溶剂还有可能有比较好的分离效果。
另外，在做标线，选择的点个数不一样，所以R也有差别，不有可比性。需要增加数据方能说明问题。

0

分
该帖子已被版主-有水有渝加2积分，加2经验;加分理由:鼓励提出疑问

liufengbuji

第2楼2010/11/16

胡萝卜素在氯仿或者正己烷易溶。

0

fengmo4668

第3楼2011/05/04

流动相B的方法好像是国标中的方法。
（参见GB/T 5009.83-2003）
小不董(doxw0323) 发表:看了楼主的文章有几个问题想咨询下，胡萝卜素是可以很好溶解在氯仿或者正己烷？所以流动相有二氯甲烷，不知为什么要比较流动相B？而且时间延迟了好多，如果说减少一种溶剂还有可能有比较好的分离效果。
另外，在做标线，选择的点个数不一样，所以R也有差别，不有可比性。需要增加数据方能说明问题。

0

小罗宾

第4楼2022/06/07

您好，我配置储备液是加BHT用二氯甲烷溶解的，然后上紫外可见分光光度计标定，结果差距很大，是什么原因呢？

0

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