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【求助】求助液相色谱进样品不出峰原因分析

  • 庐山居士
    2010/10/27
  • 私聊

液相色谱(LC)

  • 悬赏金额:0积分状态:已解决
  • 一、仪器:Varian HPLC 230泵/325紫外检测器(单波长)、配国产柱温箱、手动进样、Varian C18(5μm4.6mm×150mm).
    二、实验过程:测丹参片中丹参酮IIA溶出度
    1、配系列丹参酮IIA标准溶液(溶剂用85%甲醇),共5个标样,先在紫外分光光度计上进行光谱扫描,峰值检出,在269.3nm有最大吸收峰,再做定量测定,标准曲线相关系数为0.998,溶出介质为稀盐酸,溶出样品按时间点分别取样7个,针筒过滤器过滤,不稀释上紫外测试,30分钟前溶出不明显,测出吸光度值低,30分钟后有明显溶出,吸光度值高,位于标3与标4之间。

    下面是标样的及溶出样品的紫外定量测定图:(见17楼的补充贴)

    2、溶出条件不变,溶出样品采用液相进行测试,液相条件:检测波长270nm;流动相:85%甲醇:15%水;等度洗脱,分析时间10分钟;柱温:30度;流速:1ml/min。
    3、取丹参酮IIA标准溶液(溶剂用85%甲醇),共5个标样,分别依次手动进样,进样量100uL(定量环20uL),标样均在5.4min左右出峰,各标样保留时间非常重合,对照品标准曲线相关系数:0.996。

    下面是5个标样的色谱图,色谱图进行了偏置2%,为了利于版友观察,从前往后分别是标1-5:

    下面的图是标准曲线图,标1的峰面积有的偏小,但还是基本成线性:

    4、前面实验过程都比较顺利,在预想在范围内,问题出现在最后时刻,开始对溶出的7个时间点样品(直接从溶出杯中取样,溶剂为稀盐酸,针筒过滤器过滤)上HPLC进行测定,怪事发生了,竟然没出有一个出峰的,连一个其它的杂峰都没有,只有开始时的一个溶剂峰。

    下面是7个溶出样品的色谱图,色谱图进行了偏置2%,为了利于版友观察:


    5、原来我们做过丹参片中丹参酮IIA含量的液相测定,方法基本一致,标准曲线比较容易做,样品用85%甲醇超声定容,除了和标样在同样位置出峰外,在这峰之前还有其它成分的峰。

    下面是以前做的丹参片样品及丹参酮IIA标样的色谱图,色谱图进行了偏置2%,为了利于版友观察,前面的丹参片,后面的丹参酮IIA:


    6、我怀疑稀盐酸在其中做怪,于是调整样品配置方法,将第6、7时间点采集的溶出样品各取1mL,用85%甲醇定量到10mL,以图消除稀盐酸的影响,重新配制的第6、7的溶出样品分别进样,结果还是让人晕倒,竟然还是一条直线,除了溶剂峰外,一个峰都没有,跟进一针试剂空白一样,由于今天太晚了,没有再做其它方案调整,于是冲柱2h后走人了,谱图也忘记拷贝了。

    下面是用甲醇稀释过的溶出样品6、7的色谱图,色谱图进行了偏置2%,为了利于版友观察:


    三、回家后,想想今天真是郁闷啊!本想今天实验十拿九稳,大不了线性不好,但竟然不出峰,让我摸不着头脑,做液相以来,这次让我最纠结,急盼高手指点迷津,万分感谢!

    四、第二天调整了色谱条件,同等度洗脱改为梯度洗脱,甲醇由60%梯度到90%,先进了一针标样,看出峰靠后,于是增加了分析时间,又进了一针同样的标样,但结果都让人不满意,标样出峰很怪,标样峰前面的驼峰正常吗?

    下面是梯度洗脱方法做的两次标样,两次的分析时间不同,第一针是15分钟,第二针改为了20分钟:




    五、再次调整了色谱条件,改变梯度洗脱方式,先前甲醇由60%梯度到90%,改为甲醇由70%梯度到95%,进了一针溶出样品,看是否有出峰?

    下面是改变梯度洗脱方法进的一针溶出样品,分析时间是20分钟:


    六、问题不但没有解决,反而梯度洗脱又出了让人看不懂的色谱图,第一次梯度的色谱图中的驼峰还可以理解成梯度洗脱使得基线上漂,而第二次梯度的色谱图中驼峰与目标峰中间竟然又多出了一个峰,无法理解,再次陷入了困局,望高手再度出山,来拨云见日,多谢了!

    主贴内容在不断更新,望各位版友能持续观注!!!

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  • xue2009

    第1楼2010/10/27

    是不是样品出现什么问题?

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  • chenping0829

    第2楼2010/10/28

    你看当时的泵压没?有可能是根本没有流动相进入色谱柱

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  • liuyanning

    第3楼2010/10/28

    这个原因很多,用排除法吧兄弟

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  • 有水有渝

    第4楼2010/10/28

    应助达人

    1、怀疑紫外检测到的吸收不是所要组分的吸收,样品也做一个紫外扫描看看。
    2、色谱条件不适合,或可能是丹参片的背景物质影响比较大。

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  • xiaohui9804

    第5楼2010/10/29

    看看溶剂峰变大了没,可能稀盐酸使得样品没有保留了,与溶剂共出峰。

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  • 毛毛虫

    第6楼2010/10/29

    大致看了下来,个人觉得你样品出问题的可能性较大,一种可能是样品本身存在的问题,而是有可能你配制过程出了问题,建议你先重配样品看看,还是不行的情况下,可以换样品重新配进样试试,总之实验过程中,不能怕麻烦,多次验证下的结果才会有更好的证明度.

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  • 色色猪

    第7楼2010/10/29

    大概看了下,LZ的标准品能正常出峰,但是样品是一条直线,标准品和样品的区别只有在溶剂方面,用85%的甲醇做溶剂显然是没有问题的,关键在于盐酸可能对丹参酮IIA的稳定性方面有影响,是不是样品里面加了盐酸导致丹参酮IIA变质了呢?

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  • 〓猪哥哥〓

    第8楼2010/10/29

    庐山居士,你好

    我觉得可能有几个原因:
    1、色谱柱。因为最初使用的是盐酸为基质,对色谱柱可能有影响,更换一根色谱柱再试试。
    2、定量环。对于这个问题,更换一个六通阀或者直接更换一台仪器试试。不过这个可能性会比较小,因为原实验出现了溶剂峰。
    3、样品问题。把7个样品放入紫外下检测,看是否出峰。如果没有出峰,说明是样品处理出了问题。如果出峰,说明是液相出问题。
    4、紫外没有出峰。检查样品处理过程,盐酸的量,浓度,PH和玻璃仪器的清洁度,以及溶出仪的有关参数。
    5、如果紫外出峰了,可能的原因是样品在酸性条件下解离,结构异构化,导致出峰时间延迟。延长分析时间或使用梯度洗脱,看是否有样品出峰。

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  • 阿三

    第9楼2010/10/29

    第5点中谈到解离,如果如此,出峰会提前,没有保留的,我觉得可能分析时间不够或如前面所说没有泵入流动相

    〓猪哥哥〓(03yx2) 发表:庐山居士,你好

    我觉得可能有几个原因:
    1、色谱柱。因为最初使用的是盐酸为基质,对色谱柱可能有影响,更换一根色谱柱再试试。
    2、定量环。对于这个问题,更换一个六通阀或者直接更换一台仪器试试。不过这个可能性会比较小,因为原实验出现了溶剂峰。
    3、样品问题。把7个样品放入紫外下检测,看是否出峰。如果没有出峰,说明是样品处理出了问题。如果出峰,说明是液相出问题。
    4、紫外没有出峰。检查样品处理过程,盐酸的量,浓度,PH和玻璃仪器的清洁度,以及溶出仪的有关参数。
    5、如果紫外出峰了,可能的原因是样品在酸性条件下解离,结构异构化,导致出峰时间延迟。延长分析时间或使用梯度洗脱,看是否有样品出峰。

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  • 〓猪哥哥〓

    第10楼2010/10/30

    呵呵,我说的是因为在酸性条件下离子化后异构。不是单纯的解离

    阿三(junqiwudi) 发表:第5点中谈到解离,如果如此,出峰会提前,没有保留的,我觉得可能分析时间不够或如前面所说没有泵入流动相

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