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第6楼2010/12/07
1.3.3 残留监控中要解决的关键技术
(1) 残留快速检测技术研究
免疫分析具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和很高的灵敏度,仪器化程度低,样品前处理简单,使用方便,适用于现场监控和大量样品筛查。酶联免疫吸附测定法(ELISA)是目前应用最广泛的免疫分析技术。利用胶体金颗粒作为标记物的试纸条检测技术、偏振荧光免疫分析技术、免疫传感器等也有较大发展。免疫学检测方法是适用于基层的大规模筛选的快速检测方法,更实际更有应用前景。国内目前尚未研制出商品化的检测兽药残留的试剂盒,残留监控中主要使用国外进口的ELISA试剂盒,成本高,推广难度大,不利于我国兽药残留的监控。研究和开发具有我国独立知识产权的检测技术和产品,生产成本将大大低于国外产品,从而降低检测成本,具有很强的市场竞争力和推广前景。对提高我国食品安全检测技术水平,实现大规模普查、监控,加强我国兽药残留监控的力度,促进相关产业的形成具有十分深远的意义。
(2) 样品的分离、纯化技术
免疫亲和色谱技术、分子印迹技术、基质固相分散技术等是残留分析中最有效的分离纯化方法,目前是残留分析领域中的研究热点。免疫亲和色谱技术具有高度的选择性和特异性,特别适用于复杂样品基质中痕量组分的分离。可利用色谱柱技术制备出用于药物多残留检测的样品分离纯化IAC柱。该技术的发展方向是使生物样品中多个药物同时得到高效分离纯化,而且极有可能使将几类不同药物残留在同一根IAC柱上得到分离纯化这一多年来残留分析工作者的愿望变成现实,因此,该项研究具有重要的理论指导意义和较强的实用价值。分子印迹技术在残留分析领域的应用研究国外也刚刚起步,是残留分析研究领域的一个新的发展方向。
(3) 药物多残留定量确证技术研究
免疫亲和色谱-色谱-质谱检测技术与在药物残留研究中采用的色谱/质谱联用技术,可以集高效分离和结构鉴定于一体,是生物样品复杂混合物中痕量组分定性和定量分析的最有效手段之一。国内外有关兽药残留多残留分析的大部分报道主要集中在兽药残留的液谱-单个质谱联用技术的研究上,液谱-串联质谱(LC/MS/MS)联用技术在兽药残留分析中取得应用。另外,色谱/质谱联用检测技术对待测残留物纯度的要求极为严格,一般的样品前处理技术很难达到满意程度。兽药多残留的IAC分离纯化技术LC/MS/MS和GC/MS检测兽药残留时最有效的分离纯化手段。建立动物性食品中药物多残留的定量确证检测技术(IAC/GC/MS、IAC/LC/ MS
/MS),是残留分析研究领域的一个重要发展方向。
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1.3.4 我国食品残留科技研究的状况
我国兽药残留监控工作始于20世纪90年代初,1991年国务院办公厅发布了《关于加强农药、兽药管理的通知》。根据国办通知要求,农业部发布了《关于开展兽药残留检测工作的通知》,要求各地畜牧兽医行政主管部门负责本地兽药残留项目及检测工作的监督管理,并将兽药残留监控工作纳入兽药的管理范畴。1999年,农业部与原国家出入境检验检疫局结合我国的国情并参考国外有关法规制定发布了《中华人民共和国动物及动物源性食品中残留物质监控计划》,同时发布了《官方取样程序》。2001年,为保证动物性食品的安全,加强兽药残留监控管理工作,国务院在新修改的《兽药管理条例》中规定,县级以上人民政府畜牧兽医行政主管部门应当加强对动物产品中兽药残留的检测,并公布检测结果;兽药残留限量标准和检测方法由国务院畜牧兽医行政管理部门制定。这标志着我国的动物源性食品中兽药残留的监控工作已初步步入法制化、规范化的管理轨道。
1994年,农业部制定并发布了34种药物的最高残留限量标准;1997年修订了最高残留限量标准;1999年再次修订并颁布了109种兽药在动物性食品中最高残留限量标准;2002年参考美国、欧盟、食品法典委员会(CAC)等发达国家和组织的作法,再次修订并颁布240多种兽药在动物性食品中最高残留限量标准。2001年,农业部发布了10种动物源性食品中兽药残留检测方法,2002年,农业部发布了12种兽药在动物性食品中残留监测方法标准。兽药残留监控是一项政策性、技术性都非常强的工作,为此农业部于1999年底成立了全国兽药残留专家委员会。该委员会是在农业部领导下的技术审议咨询组织,委员主要由食品卫生、进出入境检验检疫、农药残留监控、兽药残留监控和体育运动兴奋剂检测等方面的专家组成。自1999年以来,我国已连续4年开展了动物性食品中兽药残留的监测工作,监测地区、动物种类、兽药种类、样品数量每年都有大幅度的增长。
经过十几年的工作,我国在兽药安全性评价、残留检测方法、最高残留限量和休药期的制定方面取得了很大进展,但在检测数量、范围、品种和检测技术上与发达国家相比仍有很大的差距。到目前为止,有关兽药安全评价和残留检测方法等仍主要是参考国外的资料进行研究,现在国内只有极少数单位能完成兽药安全性评价中某些方面的研究,且这些单位的实验条件均不能达到国外同类实验室的水平。目前影响我国兽药残留监控计划顺利实施的因素除了社会和管理的原因外,主要是由于我国的兽药残留监控工作起步较晚,基础薄弱,检测方法不完善,检测机构的仪器设备陈旧,检测水平不高。兽药残留检测技术的科技研究水平落后于发达国家。因此,加大资金投入,加速我国兽药残留检测方法的标准体系建设和监测体系建设是当务之急。借鉴国外先进经验,全面推动我国兽药残留监控工作与国际接轨,加强国际交流和合作,引进国外先进技术,使我国的兽药残留限量标准、检测方法标准等尽快与国际接轨,力争在一个较短的时间内使我国的兽药残留监控工作水平上一个新的台阶。
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1.3.5 残留消除研究和休药期标准制定
在动物性食品兽药残留监控过程中,最高残留限量和休药期是两个十分重要的标准。前者是监控的依据,后者是用药的依据,二者共同构成了兽药残留监控的基础。遵守最高残留限量和休药期标准的规定是避免兽药残留超标,确保动物性食品安全的关键。最高残留限量(MRLs)是指对食品动物用药后产生的允许存在于食品表面或内部的残留药物的最高含量或最高浓度。兽药的安全性、使用范围和分析方法是建立最高残留限量的基础,其中安全性是决定性的。制定最高残留限量的步骤通常包括确定残留组分,测定药物的最大无作用剂量(NOAEL),估计危害性程度(安全系数),确定食物消费系数等。
通过药物代谢动力学的研究可以明确兽药残留组分,如原形药物和代谢产物确定标示残留组分和残留检测的靶组织。通过安全性毒理学评价研究,如毒理学试验包括亚慢性试验、慢性试验(含致癌试验)、繁育试验(生殖毒性、致畸作用、发育毒性等)等,确定药物的最大无作用剂量,在综合考虑人和实验动物之间对药物的敏感性差异,结合人体对动物性食品消费情况的前提下,制定出动物性食品中兽药的最大残留限量。
休药期(withdrawal time)是指食品动物从停止给药到许可屠宰或它们的产品(即动第物性食品,包括可食组织、蛋、奶等)许可上市的间隔时间。凡供食品动物应用的药物或其它化学物,均需规定休药期。休药期的规定是为了减少或避免供人食用的动物组织或产品中残留药物超量,进而影响人的健康。在休药期间,动物组织或产品中存在的具有毒理学意义的残留可逐渐减少或被消除,直到残留浓度降至“安全浓度”即“最高残留限量”以下。在给食品动物使用药物时,在用药期间和用药后的一定时间内,不能将动物屠宰出售或其产品(奶、蛋)上市,否则,会引起动物性食品中药物残留量超标,危害人体健康。影响动物体内药物残留消除及休药期的因素很多,如药物剂型与剂量,给药途径,合并用药和重复用药,动物年龄、性别、品种及个体差异,胃肠道环境及机能状态等均能影响药物在机体内的吸收、分布或代谢,进而影响药物从体内消除和休药期。所以用科学方法来制定休药期非常重要。
制定休药期的程序一般包括确定靶组织和被测残留物,研究组织残留消除规律进行数据统计处理。较为常用的方法是实验动物经过预试后,按实际给药量和给药途径给药后,取若干个时间点(在MRLs附近至少设4个采样时间点)采靶组织样品进行残留测定绘制残留消除的半对数曲线,利用直线回归方法对数据进行统计处理,将MRLs作为统计量估计时间的99%置信限,取其上限时间作为休药期。另外,也可根据组织药物代谢动力学参数来估算休药期。
动物体内兽药残留消除规律的研究,是制定休药期标准的关键。结合我国畜牧业生产以及常用兽药及饲料药物添加剂等的使用情况,研究兽药在不同种类畜禽体内的残留消除规律,制定符合我国实际情况的各种药物休药期标准,对明确规定允许使用兽药的畜禽种类、用药时期、药物种类和剂量,明确规定禁止使用的兽药和其他化合物的种类,促进科学、合理地使用兽药具有重要的战略意义,可为全面建立畜禽产品的安全监测体系、残留监控的法律法规和技术标准体系,以及对畜禽产品中兽药残留进行监控提供科学的数据和理依据。
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1.4 抗生素在水产动物体内消除规律研究进展
1.4.1 组织动力学简介
药物组织动力学(tissue kinetics)是药代动力学(pharmacokinetics)研究的一个较新领域,是应用动力学原理探讨化疗药物在机体组织中的动态变化规律。其通过测定不同器官组织中药物浓度与时间之间的关系,阐明药物在不同器官组织中的动力学特征,较真实的反应药物在机体各组织中的分布和动态变化规律。通过监测药物组织浓度,了解靶器官组织的药物浓度与时间的关系,可为组织感染的化疗提供直接的理论依据,对制定药物最高残留限量与休药期具有重要价值。
1.4.2 几种抗生素类药物在水产动物体内的药代动力学研究
1 )氯霉素
氯霉素在生产中曾广为使用,但由于其对人类有致再生障碍性贫血的副作用, 现已禁止在食用动物养殖中使用。氯霉素在鲤鱼、鳟鱼、草鱼、银鲫、对虾等体内的药代动力学研究已见报道。李兰生等[16]报道了对虾体内氯霉素含量测定方法的研究,应用高效液相色谱(HPLC) 技术,采用大剂量投喂,分别测定各组织中药物浓度,再计算出体内药物总剂量。李爱华[17]报道了氯霉素在草鱼和复合四倍体异育银鲫体内的比较药代动力学,采用HPLC法测定血液中氯霉素的浓度,单次注射给药。Nouws 等[18]报道了氯霉素在鲤鱼和鳟鱼体内的药代动力学研究。研究结果均表明氯霉素在体内代谢的半衰期长,残留高。
2)土霉素(OTC)
OTC 是广谱的人畜共用抗生素,广泛应用于水产养殖业细菌性疾病的防治,国内外对该药的研究比较广泛。Rigos等[19 ] 报道了在两种水温条件下OTC 在舌齿鲈体内的药代动力学及组织分布。采用HPLC法测定,尾静脉注射给药。结果显示血浆药物浓度-时间数据符合二室模型。药物动力学特征与温度相关,温度高,组织中OTC 消除快,而在同样温度条件下,肝脏中OTC 消除速度比肌肉中快。王群等[20]报道了OTC在黑鲷( Sparus macrocephalus) 体内的药代动力学研究, HPLC 法测定,1次口服给药。结果表明血药浓度-时间数据符合一室开放动力学模型,药动学参数表明OTC 的吸收、消除速度缓慢。Haug等[21] 报道了土霉素在淡水北极红点鲑( Salvelinus alpinus) 体内的药代动力学。HPLC法测定,口服和注射给药。注射给药符合三室模型,口服油脂颗粒与OTC的吸收无协同作用,不能增加OTC 的生物利用度。Abedini 等[22]报道了土霉素在淡水虹鳟和海水大鳞大麻哈鱼( O.tshawytscha)体内的比较药代动力学和生物利用度。单次注射和口服给药,HPLC法测定血液浓度,两种鱼注射给药后药动学模式均符合三室开放模型,口服给药符合二室开放模型。给药方式相同时,在鳟鱼和鲑鱼得到相似的OTC 血药浓度-时间曲线图,药动学参数和表观生物利用度也非常相似。结果表明在鲑科鱼体内,种属差异和盐度对OTC 的吸收和消除影响不大,淡水鳟鱼和海水鲑鱼都可用于研究OTC 在鲑科鱼体内的药动学模型。Uno[23]报道了土霉素在健康和感染弧菌的香鱼体内的药动学研究,HPLC 法测定血药浓度。对健康香鱼采用尾静脉注射和经口灌服两种给药方式,感染弧菌的香鱼灌服给药。结果显示,健康香鱼注射给药后,药动学符合二室模型,口服给药的健康香鱼和感染香鱼其药物在体内的代谢均不符合用非线性最小二乘法拟合的一级吸收一室或二室模型。健康香鱼与感染弧菌香鱼的口服生物利用度差异显著,二者对药物的消除相似。另外,国外学者还报道了土霉素在大西洋鲑、鲤、非洲鲶、鲷和鲈、银大麻哈鱼(O.kisutch) 、琵琶湖大麻哈鱼(O.rhodurus)、五条魳(Seriola quinquera-diata) 、欧鳗等鱼体内的药代动力学研究[18, 24~32]。关于OTC 残留的研究,Mohney 等报道了OTC 在养殖细角对虾( Penaes styli rostris) 幼体中投喂14 d 药饵的残留情况,Bebak Williams等[34]报道了OTC 在淡水虹鳟循环养殖系统中鱼体及周围环境中的残留;Xu 等[35]报道了土霉素在条纹鲈( Morone sax atilis)肌肉中的残留研究;国内的辛福言等[36]报道了HPLC 法分析鲤鱼体内OTC 残留的研究;李美同等[37 ]报道了OTC 在鳗鲡组织中残留的消除规律; 陈四清等[38] 报道饲喂土霉素对鲤鱼生长及代谢残留的研究等。研究结果表明,虹鳟、鲑鱼休药21 d (水温11.5℃ ) ,条纹鲈停药16 d (水温23 ℃ ),对虾、鳗鲡休药7 d (水温23~27℃ ),组织中不再检出;鲤鱼停药5 d (水温22~28 ℃ )后可达食用标准。
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3)氟苯尼考
氟苯尼考在畜禽,如牛、猪、鸡、鸭等体内的药动学研究已有报道,在水产动物体内仅对大西洋鲑有过报道。Martinsen 等[39]报道了氟苯尼考在大西洋鲑体内的单剂量药代动力学研究,Horsberg 等[40]报道了14C-氟苯尼考在大西洋鲑体内的动力学过程,Horsberg等[41]报道了氟苯尼考在大西洋鲑体内的药代动力学及其代谢产物的研究。研究中分别采用了HPLC、全息显影(WBA) 和液体闪烁记数(LSC)法。研究结果表明,单剂量注射给药的代谢过程符合二室开放模型,口服生物利用度高,体内清除迅速,其主要代谢产物为胺类,用药观察结果表明没有不良反应。
4) 喹诺酮
Samulesen等[42]报道了FQ在大比目鱼中残留规律和代谢动力学。采取给静脉注射和口服两中方式。注射后血液中的FQ的分配和消除半衰期分别为0.8 h和43 h,血液中最高浓度是601 mg/L , 所需的时间是10 h ,生物利用度为69 % ,口服仅为31 %。在给大比目鱼注射水平为25μg/g 10 d 后,残留水平仍然超过0.25 mg/L,为最低残留限量(0.0626mg/L) 的4 倍。相应的口服为5 d。Malvisi等[43]研究了FQ在鲷科海鱼体内的分配和代谢残留规律。每天以12μg/g 的剂量连续喂药5 d,24 h 后, 皮肤中药物含量达到最高, 为317ng/g±102.6ng/g , 此时组织中的药物含量为68.7 ng/g±49.6 ng/g。肌肉中FQ在240 d后未检出,而皮肤中则需要更长时间。张雅斌等[44 ]通过不同给药方式研究了鲤鱼对诺氟沙星的药代动力学。以10μg/g 的单剂量肌肉注射、口灌诺氟沙星的药时数据符合开放性二室模型, 以10μg/g 的药物剂量单次混饲给药时数据符合开放性一室模型。研究结果表明, 不同的给药方式的药物代谢动力学差异较显著,诺氟沙星吸收快, 但消除速度慢。
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1.5 食品中 TAP 的分析方法
1.5.1 发展概述
兽药残留分析(drug residue analysis)属复杂基质中痕量组分的分析技术,与药品或制剂分析有很大不同。兽药残留分析(以下简称“残留分析”)的方法特点可概括为3个方
面:
1)待测物质浓度低,浓度波动范围大
这是残留分析的显著特点,多数残留水平为1 pg/kg~1 mg/kg。药物在体内经过吸收、分布、代谢和排泄过程,药物被代谢和稀释,浓度变化可分为潜伏期、持效期和残留期。残留期浓度较持效期一般低2~3个数量级,浓度变化的动态范围达1:1 000以上。实际残留测定或监控通常在MRLs水平(μg/kg级)上进行,如食品残留监控和休药期预测,既要求准确定量和定性,又需要考察动力学情况,对方法的可靠性(灵敏度、准确度和选择性)要求极高。
2)样品基质复杂,干扰物质多
生物材料的成分十分复杂,组成生物的分子种类和数量不计其数,而且对它们确切的理化性质了解甚少,不同种属动物的样品、同种动物的不同组织器官的成分也存在明显差异,这是导致残留样品干扰物质复杂和方法通用性差的主要原因。其他干扰因素,有药物自身的代谢产物、动物日粮成分和环境污染物等。
3)以各种仪器分析方法为主
这是由残留分析对象和仪器分析方法的特点决定的。残留样品要求分析技术具有灵敏度高、选择性或分离能力强和线性范围宽的特点。显然传统意义上的化学分析方法通常不能独立进行残留分析。
1.5.2 高效液相色谱法
高效液相色谱法是一种灵敏度较高、可靠性较强的方法。此法重复性好、假阳性少,可以进行定量鉴定,但检出限较高,为5~10μg/kg,回收率偏低。因为动物体内成分复杂,一些杂质干扰测定,应用该法检测时,对于样品预处理必须仔细谨慎,以提高测定准确性和灵敏度。
Lawrence 等[45]研究报道了检测牛血清中甲砜霉素的液相色谱法。用乙酸乙酯提取组织中的甲砜霉素,蒸发至干,用流动相将残存物溶解。液相色谱分析采用了 UltrasphereC18 色谱柱,紫外检测器检测,回收率达 90.0%以上,检测限为 0.1μg/mL。Psomas 等[46]研究了牛肉中甲砜霉素残留的高效液相色谱检测方法。用乙酸乙酯提取组织中的甲砜霉素,蒸发至干,将残存物溶于 4%的 NaCl 溶液中,加适量正己烷后,用乙酸乙酯提取。
液相色谱分析采用了 Hichrom C18 色谱柱,紫外检测器检测,回收率为 64.8~75.5 %以上,检测限为 5μg/kg。日本 Tomoko Nagaka 等[47]报道了用 2 种波长的液相色谱法对肌肉组织进行多残留分析。该方法用乙酸乙酯提取肌肉组织中的药物,提取液蒸干,残存物溶于 3%氯化钠中并加适量正己烷去除溶液中脂类物质,用 sep-pak Florid 柱提纯净化。色谱条件:Chromatorex ODS 柱,紫外检测器 225nm 或 270nm, 流动相甲醇-水(15∶ 8 5),最低检测限为 0. 0lmg/kg。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素平均回收率大于
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1.5.3 气相色谱法
气相色谱法的特点是高分离效能、高选择性、高灵敏度、快速、应用广。它可以对于分配系数相差很近的组分进行分离,从而分离出极为复杂的混合物。检出限低,有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用,如氢焰离子化检测器(FID) 、电子捕获检测器(ECD) 、氮磷检测器(NPD) 等,检出限一般为 μg/kg 级,常用于抗生素药物残留的检测。但是大多数兽药极性或沸点偏高,需繁琐的衍生化步骤,因而限制 gc 的应用[48] 。
气相色谱检测法中最为灵敏的方法是 1974 年 10 月 AOAC 年会上由 Jacabson 等[49] 提出的。该方法用乙酸乙酯提取动物组织中的药物,用含 4%NaCl 溶液溶解残渣,正己烷除脂,通过硅藻土色谱柱提纯净化,加入四甲基硅烷(TMS)衍生化,最后进样检测。肌肉样品的回收率大于 80% ,检出限低于 1μg/kg。色谱条件:电子捕获检测(ECD),Gas-ChromQ 柱(含有 4%Se-30),流动相为氢-甲醇(95:5)。Gazzaniga 等[50]研究报道了血液、尿和组织中的甲砜霉素的气相色谱检测方法。该方法用乙酸乙酯提取体液中的药物,四甲基硅烷(TMS)衍生化。用火焰离子检测器检测,检测限为 0.2~0.4μg/mL。
甲砜霉素的添加试验回收率为 50~80%。Allen 等[51]建立了牛奶中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的气相色谱检测方法。该方法用乙酸乙酯提取体液中的药物,四甲基硅烷(TMS)衍生化。用 63 Ni 电子捕获检测器检测,检测限为 0.01μg/mL。甲砜霉素的添加试验回收率为 100%以上。Allen 等[52]建立了对虾组织中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的气相色谱检测方法。该方法用乙酸乙酯提取体液中的药物,四甲基硅烷(TMS)衍生化。用 63 Ni 电子捕获检测器检测,检测限为 5ng/g。甲砜霉素的添加试验回收率为 84%以上。Plomp 等[53] 报道了血液和羊水中甲砜霉素快速气相色谱检测方法。该方法用乙酸乙酯提取体液中的药物,四甲基硅烷(TMS)衍生化。用 63 Ni 电子捕获检测器检测,检测限为0.1μg/mL。甲砜霉素血清的添加试验回收率为 91.3%,羊水的回收率为 90.3%。中国人民共和国行业标准 SN 0199 -93[54], 规定用气相色谱法测定甲砜霉素残留。其方法是样品中待测物用丙酮提取,提取液离心后加入 3%NaCl 溶液,再用乙酸乙酯提取两次,蒸除乙酸乙酯后,加入乙腈及正己烷,振摇均匀,分取乙腈层,真空除去乙腈。乙酸乙酯+乙酸酐+吡啶乙酰化,用硅胶柱纯化,用配有火焰检测器的气相色谱仪测定。最低检测限为 0.5mg/kg。甲砜霉素浓度在 0.1~1.0mg/kg,回收率为 80%~99%。王建华[55] 研究报道了同时测定鱼肉中氯霉素和甲砜霉素残留量的毛细管气相色谱法。样品中待测物用乙酸乙酯提取,浓缩至干,溶于水用正己烷脱脂,水层过 Sep -C18 小柱净化,甲醇洗脱后用N,O -双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA) +1% ( ф)三甲基氯硅烷(TMCS)衍生,加入甲苯并用水灭活衍生过程,用带有63Ni电子捕获检测器的气相色谱仪检测,外标法定量。当添加水平(W)为 5 ×10 -9~20 ×10 -9 时,回收率为 80%~107% 。相对标准差为4.5%~11% ;线性相关系数 r >0.997 。
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1.5.4 气质联用法
Tomoko Nagata 等[56] 报道了用气相色谱-质谱法检测黄鰤鱼肌肉中的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的残留。该方法采用了对 3 种药物具有相似响应因子的电子捕获检测器(ECD),使得 3 种药物能在低浓度时同时检测到。用乙酸乙酯提取药物,并将提取液蒸干,残存物溶于 NaCl 溶液中,加适量正己烷去除脂类物质,然后再用乙酸乙酯提取药物,蒸干后将残留物用正己烷溶液和乙醚溶解,用 Sep-Pak Florisil 柱提纯净化,提取物在 50℃条件下经衍生化后,用气谱-质谱联用机检测,药物由包被有 5%苯基甲基硅的毛细管柱分离,回收率大于 65% ,最低检测限为 5μg/kg。
1.5.5 高效液相色谱串联质谱法
陈小霞等[57]研究了鸡肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的高效液相色谱-电喷雾电离三级四极杆质谱检测方法。该方法采用多反应检测负离子模式,可一次对鸡肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素进行定性和定量。该方法对甲砜霉素的检出限为0.010μg/kg,测定限为 0.100μg/kg,回收率为 77.0~88.7%。彭涛等[58]研究了虾中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的高效液相色谱串联质谱检测方法。该方法采用多反应检测负离子模式,可一次对鸡肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素进行定性和定量。该方法的对甲砜霉素的检出限为 0.050μg/kg,回收率为 78.6~99.5%。
1.5.6 其它检测方法
Nagata等[59]研究报道了柱液相色谱法检测鸡肉中甲砜霉素残留的检测方法。该方法用乙酸乙酯提取肌肉组织中的药物,提取液蒸干,残存物溶于10%氯化钠中并加适量正己烷去除溶液中脂类物质,用sep-pak Florid 柱提纯净化。液相色谱分析采用了NucleosilC18 色谱柱,紫外检测器检测,回收率达90.0%以上,检测限为0.05 mg /kg 。
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(2) 根据表 2-2 中半抗原 TAP 的最大吸收波长下的数据估算两者的交联率
根据大分子与小分子偶联前有各自不同的紫外吸收峰,偶联后表现出紫外吸收峰偏移的性质,根据公式K=A/CL 分别求出两物质在两波长处的摩尔吸光系数,再由公式Ca/Cb=(AC am·KBbm-ACbm·KBam)/(ACbm·KAam-ACam·KAbm) 即可求出两物质摩尔浓度比值。(其中KAam与KBbm分别表示A、B 两物质在A 物质、B 物质最大吸收峰波长处的摩尔吸光系数,KAbm 与KBam分别表示物质A 在物质B 的最大吸收峰波长处摩尔吸光系数、物质B 在物质A 的最大吸收峰波长处的摩尔吸光系数,ACam和ACbm为吸光值或光密度值,即OD 值,C 为浓度,L 为光程,脚标 a, b 表示物质a 和物质b,脚标 m表示最大吸收波长)。
定点检测适当稀释后的 TAP-BSA 在相应TAP 和BSA 最大波长处的光吸收值,由公式Ca/Cb=(ACam·KBbm-ACbm·KBam)/(ACbm·KAam-ACam·KAbm) 即可求出两物质克分子浓度比值。经过计算,TAP与载体蛋白的偶联比为1﹕12.5 ,同法测得的TAP与OVA的偶联比为1:7.8 。结合抗原鉴定的的一个基本方面是确认半抗原与载 体蛋白的的连接和测定结合比。一般认为,半抗原结合比过高或过低均影响抗体的产生,以5~15 为宜。但是一些实验结果表明,半抗原的结合比的大小对诱导抗体产生并无决定性的影响,每分子蛋白质只连接一个半抗原也可以产生特异性抗体,并且低结合比可能有助于提高抗体的选择性和亲和力。本实验的完全抗原结合比为1﹕12.5,可以诱导产生抗体。TAP与OVA偶联,合比为1:7.8作为包被抗原。
2.3.3.3 TAP-BSA 的 SDS-PAGE 分析
在透析结束以后,进行了 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳实验,结果见图 2-6。图 2-6 TAP-BSA 的 SDS-PAGE 图
Fig.2-6. The SDS-polyacrylamide gel electrophoresis figure 1.marker;2.TAP-BSA;3.BSA
diluted by 1:32
从电泳图的泳道 2 可以看出,TAP-BSA 的电泳条带明显滞后于载体蛋白质BSA 的电泳条带,由于电泳样品 BSA 和 TAP-BSA 的蛋白质含量相同,因此可以推知 TAP-BSA 的相对分子质量(Mr×103)大于 BSA 的相对分子质量,也即 TAP 已与 BSA 结合形成 TAP-BSA。从图中也可以看出,纯化后的产物也是一条谱带,说明纯化的偶联产物达到一定的纯度。2.3.3.4 动物免疫实验
虽然,从实验反应过程中的现象,紫外扫描实验和电泳实验可初步推知 TAP分子确实已经结合到 BSA 分子上了,但合成的 TAP-BSA 能否刺激动物产生针对TAP 分子的抗体只有通过动物实验来验证。
对免疫所得到抗血清进行双向免疫扩散法检测,从图 2-7 可以看到,抗血清既可以和 TAP-BSA 与 BSA 反应形成可见的沉淀线,也可以与 TAP 和 TAP-OVA 反应形成可见的沉淀线,而不与 PBS 及 OVA 反应形成可见的沉淀线,可以推知抗血清中不仅含有针对 BSA 的抗体,同时,也含有针对 TAP 的抗体。从而说明完全抗原合成成功。
图 2-7. 抗血清双向免疫扩散图
Fig.2-7 Double direction immunodiffusion
1. PBS;2. BSA; 3. TAP-BSA; 4. OVA ;5. TAP-OVA; 6.TAP;Middle core:
antiserum diluted by 1:32
职业游民
第21楼2010/12/07
2.3.3.5 TAP 酯化分析
虽然 TAP 分子中含有羟基,但是 TAP 分子的空间结构复杂,如果直接和蛋白质偶联,有可能改变蛋白质的构象,使得免疫动物不能识别 TAP 分子,得不到抗体。因此有必要延长碳链。这样在不改变 TAP 分子结构的情况下,很好的和蛋白质结合。在合成 TAP 酯化产物的过程中,TAP 要过量,这样可以减少副产物,在反应过程中,要保持干燥的环境。实验中发现,如果有水分存在,几乎不能到想要的产物。
2.4 本章小结
1. 通过酯化反应,合成了 TAP 酯化产物,HPLC/MS 鉴定结果表明,获得产物就是应得的 TAP 酯化产物;
2. 利用混合酸酐法合成 TAP-BSA 偶联物,构建 TAP 完全抗原并进行鉴定。起始的摩尔比和合适的反应溶剂系统是提高偶联比和 TAP-HS 利用率的主要因素。本实验起始的摩尔比为 TAP-HS:载体蛋白 BSA 为 50︰1,采用二甲基甲酰胺 DMF 和 PBS(pH8.0) 溶液混合系统,所得偶联产物的偶联比为 1︰12.5 ;
3. 通过紫外扫描,在同样的浓度下,TAP-BSA 的吸收值比 BSA 低,说明偶联物有可能合成成功,在 SDS-PAGE 分析中,TAP-BSA 明显滞后 BSA,说明了蛋白质的结构有了变化,最后通过动物实验,得到了抗 TAP 的抗血清,三者联合验证了偶联物是合成成功的。第二章 甲砜霉素完全抗原的合成与鉴定