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蜂蜜中红霉素残留量的检验方法的不确定度评估报告
1 目的
进出口动物源性食品中红霉素测量结果的不确定度测评。
2 依据
《红霉素（Erythromycin）检测作业指导书》。
3 范围
动物源性食品蜂蜜。
4 方法概要
4.1样品制备。
┅┅取1.0±0.05g蜂蜜样本，加入2ml去离子水，涡动2 min至蜂蜜全部溶解，加入100ml0.1M氢氧化钠溶液；涡动混匀，再加入8ml三氯甲烷，充分振荡5min；3000g以上，室温（20-25℃/68-77°F）离心5 min；
┅┅去除上层的杂质相，取下层有机相4ml，50-60℃水浴氮气吹干/ 旋转蒸发至干；
┅┅加入1ml复溶工作液，涡动5min；
4.2测量样品。将样品经酶联免疫反应，在酶标仪中， 450nm/630nm条件下检测，在450nm /630波长下检测吸光度，吸光值与样品中的红霉素浓度成反比。
4.3标样制备。将标液在实验前20min取出，恢复到室温，使用前摇匀。
4.4比较定量。待测样品与标准溶液比较定量。
4.5实验条件和引用数据。本实验在室温下进行。本法红霉素的加标回收率为(90～110)%。
5数学模型
y = C×F×V×100/（ m×100）………………………（1）
式中：y——红霉素的含量（ppb）；
C——进样样液的浓度（ppb）；
F——稀释倍数;
V——定容容积，vL;
m——样品的质量，g。
6仪器设备、计量器具、标准物质
①移液枪检定
移液枪检定点(μL)
|
容量相对误差(%)
|
重复性(%)
|
| 10 | +3.8 | 1.7 |
| 50 | +2.5 | 0.5 |
| 100 | +2.7 | 0.2 |
| 1000 | +1.2 | 0.1 |
②A级移液管10 mL，允差为±0.020 mL；
③A级容量瓶，100 mL, 允差为±0.10 mL；
④A级容量瓶，1 000 mL, 允差为±0.40 mL；
⑤电子天平，0～200 g，允差为±0.000 2 g；
⑥CAS： 114-07-8红霉素标准储备液，ρ=1ppm，U=±0.50%，k=3。
7计算测量结果及标准差(单位：ppb)
在重复性条件下，对蜂蜜样品进行5次测量，5次测量数据为0.358 0.331 0.355 0.351 0.351平均值0.349ppb；单次测量标-准偏差s=0.009ppb平均值的标准偏差sa=0.009/51/2=0.004ppb；
8 不确定度分量的识别、分析、量化
按照式（1），不确定度来源有10
①总重复性u0 (8.1)；
②质量m的标准不确定度u1（8.2）；
③体积V的标准不确定度u2（8.3）；
④稀释倍数F的标准不确定度u3（8.4）；
⑤浓度c的标准不确定度u4（8.5）；
⑥红霉素标准储备液的标准不确定度u5(8.6)；
⑦稀释过程引入的标准不确定度u6(8.7)；
⑧取样引入的标准不确定度u7(8.8)；
⑨试剂空白导致的标准不确定度u8(8.9)；
⑨消化回收率引入的标准不确定度u9(8.10)。
8.1总重复性u0
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 0.841 | 0.823 | 0.831 | 0.842 | 0.855 | 0.831 | 0.829 | 0.876 | 0.815 | 0.827 |
| s（y）=0.0055 u（y）=s（y）/101/2=0.0010 u(y)rel=0.0021 |
8.2质量m的标准不确定度u1
天平的MPE为±0.000 2 g，矩形分布，k=31/2，两次称量获得样品质量(空瓶质量m1和样品质量m2)，u1=0.000 2×21/2/31/2=0.000 16 g，那u1rel=0.001 6 g/10.00 g=0.000 16。
8.3体积V的标准不确定度u2
8.3.1 100 mL的A级容量瓶允差为±0.10 mL，矩形分布，k=31/2，
u（2.1）=0.10/31/2=0.058 mL；
8.3.2温度影响
定容时容量瓶及溶液的温度与校准温度(20℃)不同。与液体相比，容量瓶的体积变化可忽略。实验室全年温度控制在20±5℃，矩形分布，水的膨胀系数为2.1×10-4℃，则
标准不确定度分量u（2.2）=（100×5×2.1×10-4）/31/2 =0.0606mL
8.3.3结果判定误差可忽略，那么合成V的两个分量u（2.1）和u（2.2）
得V的标准不确定度u2= (0.060 62+0.0582)1/2=0.083 9 mL，那么u2rel=0.083 9mL/100 mL=0.000 8mL。
8.4稀释倍数F的标准不确定度u3
8.4.1 A级移液管10 mL，允差为±0.020 mL，假定为矩形分布，k=31/2,u(3.1)=0.02/31/2=0.011 5。
8.4.2温度影响评定方式同8.3.2，则标准不确定度分量u(3.2)=（10×5×2.1×10-4）/31/2 =0.006 1 mL
8.4.3读数判定误差可忽略，那么合成C1的两个分量u(3.1)和u(3.2)
得C3的标准不确定度u(c3)= (0.011 52+0.00612)1/2 = 0.012 5 mL
u3rel=0.012 5 mL/10 mL=0.001 25
8.5浓度c的标准不确定度u4
制备1个红霉素标准溶液c，每个浓度用高效液相法测定两次：
表2红霉素标准溶液浓度c和峰高ί
| ci ppm | ί1 | ί2 |
| 0.5 | 157901 | 157401 |
本例对样品测定液测量10次(p=10)；其峰高ί0为38 94.7；得样品质量浓度c0=0.0123 ppm，k=3，u4=0.0123/3=0.004 ppm那么u4rel=0.004ppm/0.5ppm =0.0008。
8.6 红霉素标准储备液的标准不确定度u5
红霉素标准储备液的扩展不确定度为±0.50%，k=3，u4=0.005/3=0.001 6那么u5rel=0.001 6 ppm /1ppm =0.0008
8.7稀释过程引入的标准不确定度u6
1 000 μL刻度吸管的允差为±0.007，假定为矩形分布，k=31/2，u5=1000 μL×0.007/31/2=4.04μL，那么u6rel=4.04 μL/1000 μL=0.00404 μL。
8.8取样引入的标准不确定度u7
取样引入的不确定度由天平的最大允许误差构成。因严格按照在检测方法操作说明，因此 取样引入的标准不确定度可以忽略不计；
8.9 试剂空白导致的标准不确定度u8
8.9.1 使用色谱纯级三氯甲烷，符合GB 682-89的要求，因此扣除空白导致的红霉素的微小变化产生的影响可忽略。
8.9.2 使用实验用水一级水，符合GB/T 6682-1992一级实验用水的要求，因此扣除空白导致的红霉素的微小变化产生的影响可忽略。
8.9.3使用分析纯级氢氧化钠，符合GB 5175-2000的要求，因此扣除空白导致的呋喃妥因代谢物的微小变化产生的影响可忽略。
8.10消化回收率引入的标准不确定度u9；
从资料1可知，本法红霉素的加标回收率为(80～105)%，上界为105%，下界为80%，半宽为(99－81)%/2=12.5%。它服从矩形分布，u9=u7rel=12.5%/31/2=0.0725。
表3 各不确定度分量值
| 不确定度分量ui | ui的量值 | yi或xi的量值 | uirel [=ui/(yi或xi)] |
| u0 | 测量重复性 | 0.0055ppb | 0.837 | 0.0065 | 3 |
| u1 | 样品质量 | 0.001 6 g | 1.00 g | 0.0016 | 2 |
| u2 | 定容体积 | 0.083 9 mL | 100 mL | 0.0008 | 7 |
| u3 | 样液稀释倍数 | 0.012 5 | 10 | 0.00125 | 5 |
| u4 | 标准溶液浓度 | 0.005ppm | 0.5ppm | 0.001 | 6 |
| u5 | 标准储备液 | 0.001 6μg/mL | 1μg/mL | 0.0016 | 4 |
| U6 | 稀释过程 | 4.04 μL | 1 000 μL | 0.00404 | 1 |
| U9 | 消化回收率 | 0.0725 | 1 | 0.0725 | 8 |
10、合成标准不确定度uc(y)
10.1计算相对合成标准不确定度
uc(y)= [u 02+ u12+u 22+ u 32 +u 42+ u 52+ u 62+u 92]1/2
= 0.0729
10.2计算绝对合成标准不确定度uL(L)
uL(L) = L×u(L)/L= 0.349×0.0729=0.0254
11、扩展不确定度
取k=2，U=k×uc(y)= 2×0.0254=0.0509
12、测量结果
y=0. 349，U=0.0.509，k=2。
13、结论
（1）根据 JJF 1059-1999《测量不确定度评定与表示》规定，如果某个不确定度分量值小于合成不确定度分量值的1/10，或某个不确定度分量值小于另一个不确定度分量值的 1/3时，该不确定度分量可以忽略不计。据此，由分析天平引入的不确定度分量值很小，因而可以忽略不计。
（2）在重复测定的条件下，测定结果的不确定度仅与溶液中的芳香胺质量浓度有关。因此，可以把配制标准物质及溶液体积引入的不确定度看成是一常量，将评定过程转变为简单的数学模型，而不必每次都对各个不确定度的分量进行评定。
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