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【分享】PCR及Western blot 以及细胞免疫组化实验操作规程

老好人

2010/12/30

1. 细胞总RNA的提取

1、取出培养瓶，沿瓶壁小心倒掉培养基，用冷的PBS清洗2遍。

2、吸弃PBS，对于50 ml培养瓶，每瓶加入0.9 ml RNA裂解液；对于6孔板，则每孔加入0.6 ml RNA裂解液。

3、用1 ml移液器反复吹打40次，直至裂解液中无明显沉淀。

4、将各培养瓶中的裂解液分别收集至1.5 ml EP管中，各管编号。

5、加入0.2 ml氯仿（总体积的1/5，作用为沉淀提取RNA），于涡旋器上振荡15 S，待管内液体充分乳化为乳白状后，静置3 min。

6、4 ºC离心15 min，转速为12,000 g。

7、从离心机中取出EP管，此时匀浆液分为三层：无色的上清液（含RNA）、中间白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。小心吸取上清液转移至另一新的EP管中（切勿吸出白色中间层），各管编号。

8、加入0.5 ml异丙醇（与吸出的上清液等体积，溶解RNA），于涡旋器上充分混匀，静置10 min。

9、4 ºC离心10 min，转速为12,000 g。

10、小心吸弃上清，沿管壁缓慢加入75%的乙醇1 ml（切勿触及沉淀），于涡旋器上充分振荡后，4 ºC离心5 min，转速为7,500 g（g为重力加速度,低速离心时转速用rpm表示,高速离心时转速用g表示）。

11、弃乙醇（在不触及管底沉淀的前提下尽可能吸弃完全），室温干燥沉淀5 min（不能完全干燥），加入25 μl RNase-free 水溶解沉淀。

12、RNA电泳：取3 µl RNA与1µl Loading dye（是跑琼脂糖凝胶用来染DNA的染料,它是和loading buffer按一定的比例混合而成的.有的进口试剂buffer里已经加了loading dye的,就不用加了.试剂说明书都有说明的. marker是直接加到凝胶里的.）充分混匀后，加入琼脂糖凝胶（1%）中，进行电泳分析。28S与18S的相对亮度约为2:1，若比值下降则说明RNA降解。剩余的RNA于-80 ºC冷冻保存。

2. cDNA逆转录分析

1、逆转录分析的实验步骤详见图1。

2、逆转录后所得的cDNA保存于-20 ºC，以待分析。

3、逆转录完毕，取2 µl cDNA与1µl上样缓冲液混匀，进行琼脂糖（1%）电泳分析。如各条带亮度相差过大，说明逆转录失败，则不能进行PCR分析。

3. RT-PCR反应实验

1、PCR操作前，先将cDNA从冰箱取出，于室温下静置5min左右，然后以4,000rpm离心数分钟，再行下述操作。RT-PCR反应体系的组成详见表1。

2、RT-PCR的反应操作均于冰盒中进行。

图1. cDNA逆转录反应操作步骤（注：Oligdt与Rnase free H2O混合后分装至各样品管，一般多配1个样品的量；dNTP、5×buffer与RNA inhibitor混合后分别加至各样品管，亦多配1个样本的量；AMV Rtase需每个样品单加。）95度灭活逆转录酶。

表1. RT-PCR扩增反应体系组成

4. 凝胶电泳实验

1、准确称取0.3 g 琼脂糖，加入20 ml TAE电泳缓冲液，加热溶解。

2、加入0.2 μl Godview（其终浓度应为1%），充分混匀。

3、待凝胶液稍冷却后，缓慢倒入凝胶槽中。

4、将凝胶槽置于4 ºC冰箱，待其自行冷却。

5、置凝胶槽于电泳仪中（凝胶需在电泳液的液面以下），加样孔朝向负极。

6、取5 μl PCR扩增产物与1 μl 上样缓冲液：于PE手套上充分混匀后加入各凝胶孔内。

7、电泳。将电流设为150 mA，以使电泳条件为恒压状态，电压设为80 V，电泳时间视实际扩增的产物而定。

8、取出电泳完毕的胶条，进行凝胶成像分析。

Oligdt:随机引物。对于真核生物来说，RNA末端有一段保护用的PolyA序列，也就是一长串AAAAAAAAA的碱基，大概十多个碱基，所以我们会用oligdT引物来逆转录。而原核类的没有PolyA结构，所以用随机引物来跟RNA碱基互补配对，随机引物就是包含了所有碱基组合的引物（如八聚体的随机引物有4的8次方中序列的引物在里面），RNA加热后变成单链的线性状，这时再降低温度退火（0度），引物就跟RNA配对结合了，然后在40多度的环境下由逆转录酶合成与RNA互补的另一条链，这样就得到cDNA了 RNase是RNA酶。RNase-free：无RNA酶。Rnase free H2O：无RNA酶水，即DEPC水。Buffer:：缓冲液。缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，△pKa值为-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在实际PCR中，pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。

附录2：Westernblot 操作规程

（一）细胞裂解及蛋白样品的定量处理

1、将培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次后，用细胞刮刮取贴壁细胞，离心后弃上清。

2、加入适量裂解液（具体体积视所检测的目标蛋白而定），于冰上反复吹打2min（切忌将气泡带入离心管中）。

3、吹打完毕，将裂解产物全部转移至预冷的微量离心管中，置于冰上，每5min振荡一次，共孵育30min，以使其充分裂解。

4、4 ºC离心12,000g，离心时间为15 min。

5、每管各取10 µl上清液，进行蛋白定量（每个样品重复2孔）。

6、将各管上清液全部转移至新预冷的微量离心管中，记录各管的裂解总体积；以蛋白浓度最低的管为标准，用裂解液将其余各管调整至与该管相同的浓度；将各管样品与5×上样缓冲液混合后，于沸水中煮10min，即为蛋白样本；最终的样品于-80 ºC保存。

（二）组织裂解操作方法

1、用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解。

2、将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨。

3、每约5 mg加入约300μl 预冷的裂解液，冰浴匀浆后置于4 ºC摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml)。

4、4 ºC离心12,000rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。

（三）Westernblot 操作规程

1、封闭胶槽。灌胶之前，先用胶条封闭胶槽底部，再用5ml注射器将0.5%琼脂糖沿胶槽边沿快速（避免琼脂糖凝固）注入封闭胶槽。

2、配胶。浓缩胶的配制方案详见表1，分离胶的浓度选择详见表2，分离胶的配制方案详见表3。配胶时最后加TEMED。

表1.浓缩胶配制方案

表3. 分离胶的配制方案

3、分离胶的灌制。用注射器沿倒胶槽边缘迅速注入分离胶，每块胶按5ml配制即可。分离胶灌制完毕，于其上加入1ml去离子水，以防止胶面氧化。为使电泳槽两侧胶面的电泳速度一致，两侧胶槽内的分离胶及水的体积应保持一致。

3、浓缩胶的灌制。待分离胶凝固后（约50min），倒去胶面上层水，用滤纸吸干。沿胶槽边缘迅速注入浓缩胶，每块胶按4ml配制即可。然后，将梳子沿水平方向轻轻插入，防止气泡进入胶层。

4、蛋白样品准备。取出蛋白样品，于沸水中煮10min。煮好后瞬时离心，并置于37 ºC水浴箱中备用。

5、1×电泳缓冲液配制。去离子水400 ml，5×SDS电泳缓冲液100ml。

6、将浓缩胶放入电泳槽中（若只电泳一块胶，则胶槽另一侧需垫一块玻璃板），将电泳液缓慢注入电泳槽，槽内电泳液需漫过内侧的玻板，外侧需漫过金属线。加液完毕，轻轻拔掉胶条。

7.预电泳。在每块胶上任选择一电泳孔，加入20 μl左右上样缓冲液，在80V电压下进行电泳，直至上样缓冲液全部从分离胶中分离并进入电泳液中。

8、上样。待浓缩胶凝固后上样（约30min）。按照各管样品的总体积，算出其实际上样量（理论上样体积为30µl），加样前先用200µl加样器将样品轻轻混匀，上样速度要慢，否则样品易溢出加样孔。每加一个样品，进样针需用去离子水反复冲洗数次，再用电泳缓冲液润洗数次，以免交叉污染。蛋白Marker的上样量为4µl（不足30 µl时，以1×上样缓冲液补足）。上样完毕，在加样孔的两侧分别注入30µl1×上样缓冲液，以防止边缘效应。进样针用完后，先用去离子水清洗数次，再用甲醇反复冲洗，最后用去离子水清洗晾干后保存。

9、电泳。电泳采用恒压模式，先选择80V电压，待上样缓冲液运动至浓缩胶与分离胶分界线处时，将电压调整至100 V。待胶条中蛋白Marker的各条带彻底分离时，即可终止电泳。

10、切胶。电泳结束，取出胶槽中的玻璃板，根据目的蛋白大小，对比蛋白marker的相应位置，切下所需胶条，同时在靠近正常对照组一侧的左上角切一小块作为标志，然后将胶条置于1×电转液中。

11、电转前的准备：① 电转膜的准备。根据胶条的大小裁剪PVDF膜，并在膜的一角斜切以作为标志，然后将膜置于甲醇中浸泡2min后，迅速转移至电转液中，继续浸泡15 min（PVDF是疏水性的，在转膜缓冲液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润。用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合）。②大蛋白（>100kD）易在凝胶里形成聚集沉淀，故转膜时在电转液中加入终浓度为0.1%的SDS，以避免出现这种情况；甲醇易使SDS从蛋白上脱失，故对大蛋白分子转膜处理时，应将电转液中甲醇的浓度降至10%，以防止蛋白沉淀。

12、滤纸的准备。根据所切胶条的大小裁剪滤纸（3张叠在一起），并将其浸于电转液中备用。所剪滤纸的长及宽均较PVDF膜小2mm，以防短路。

13、转胶。将夹子打开使黒的一面保持水平，其上垫一张海绵垫，用1ml枪头擀走里边的气泡；在海绵垫上垫三层滤纸，亦需擀走气泡；第3层放置胶条（胶条有切口的一侧位于左上角）；第4层为膜（膜的切口与胶条的切口相对应），第5层为滤纸；第6层为海绵垫。电转液中含甲醇，操作时需带PE手套。

14、转膜。将夹子放入电转槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转时会产热，应将电转槽放入盛有冰块的盆中。转膜时间视目标蛋白的分子量而定，恒流转膜（250mA），各目标蛋白的转膜时间如下：Bcl-2（28kD）、Bax（21kD）及Casepase-3（35/17/21kD）转膜时为50min；p38（38kD）、ERK（42/44kD）、SAPK（46/54kD）、β-actin（43kD）、及IκB（41kD）转膜时间为70min；Akt（60/56kD）转膜时间为90min；NF-κB（65kD）转膜时间为120min；PI-3（85kD）、VCAM-1（110kD）及ICAM-1（85-110kD）转膜时间为240min。

亦可进行半干转，条件如下：0.6 mA/cm²（Biorad公司电转仪），转膜时间视蛋白的分子量而定。

15、转膜完毕，回收电转液，将膜置于电转液中漂洗数分钟。

16、PBST配制。250μl Tween20加到500 ml PBS中即可。

17、① 5%脱脂奶粉配制：1.5g奶粉加30 ml PBST。②5%BSA配制：磷酸化蛋白应使用5%BSA封闭，因为脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，此时使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。

18、将膜置于5%的脱脂奶粉或BSA中，于摇床上封闭1h。封闭完毕，以PBST漂洗1次。

19、一抗的准备。将一抗贮存液按说明书提供的稀释倍数，用5%脱酯奶粉稀释成应用液。

20、一抗的孵育。一抗孵育可按以下两种方法进行：1）剪一PE指套；将PBST加入PE指套中，检查是否漏液；将膜加入指套中，再加入一抗，膜的正面朝下。2）取一培养皿，培养皿的底预先铺一层石蜡，培养皿的盖预先铺一张浸有去离子水的滤纸；将膜置于培养皿中，正面朝上，将抗体滴于其上（约1ml左右）。将加有一抗的膜在摇床上室温轻摇1 h，冰箱里4ºC封闭过夜。一抗的孵育时间取决于抗体与蛋白的亲和性及蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。尽可能选择低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在4ºC进行，否则会产生污染而破坏蛋白（特别是磷酸基团）。

21、取出一抗，以PBST漂洗3次，每次5min。

22、按说明书提供的稀释倍数，用5%脱脂奶粉配制二抗。二抗孵育的滴加步骤亦与一抗相类；将加有二抗的膜室温下于摇床上轻摇1h，振摇时注意正面朝下。

23、取出二抗，以PBST于摇床上漂洗3次，每次5min。

24、化学发光反应。取出ECL发光试剂，吸取等体积的A液和B液配成反应液，充分混匀。将膜从PBST中取出并用滤纸吸干，放入已用石蜡填平的培养皿中，再加入配好的发光反应液，放入图像采集仪内成像，根据图像的亮度调整曝光时间。

附录3：细胞免疫组化操作规程

1、PBS洗细胞3次，每次5min.

2、4%多聚甲醛固定（以PBS溶解，溶解时需加热至60°C，同时加数滴1mol/l的NaOH），时间30min。

3、弃固定液，PBS洗3次，每次5min.

4、0.4%H₂O₂孵育10min（9.5ml甲醇+0.35 ml H₂O₂+0.15ml 30%H₂O₂），以抑制过氧化物酶。

5、弃上清，PBS洗3次，每次5min.

6、0.3%Triton（先配成3%的贮存液，临用时稀释。以PBS溶解，溶解时需加热至37°C），室温孵育25min。

7、弃上清，PBS洗3次，每次5min.

8、羊血清封闭10min.

9、弃血清，加一抗，4°C过夜。

10、次日，37°C 继续孵育1 h后，PBS洗2次，每次5min.

11、加二抗，37°C孵育1 h.

12、PBS洗2次，每次5min.

13、加DAB显色，至背景为浅黄色。

14、弃上清，PBS洗3次，每次5min.

15、苏木精染色5-10min.

16、弃苏木精，水洗数次。

17、饱和碳酸锂染30S.

18、弃碳酸锂，水洗数次。

19、盐酸酒精脱色，过一下即可。

20、弃上清，水洗数次。

21、微风吹干（一定要吹干，否则镜下非常模糊）。

22、梯度酒精透明，75%酒精30S；80%酒精30S；95%酒精1-2min；100%酒精2-3min.

23、二甲苯透明5-10min，充分风干。

24、10%磷酸甘油封片（甘油与PBS按1:9比例配制），镜检。

注：酸酒精：acid alcohol (0.5% concentrated HCl in 70%ethanol/water)

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