【分享】微生物的分离、培养和菌种保藏

去年冬天

2011/05/04

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食品毒素/微生物检测

在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。为了研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株，获得纯培养。获得纯培养的方法，称为微生物的纯种分离法，这一过程称为微生物的分离和纯化。

欲从含有多种微生物的样品中直接辨认出，并且取得某种所需微生物的个体，进行纯培养，那是困难的。由于微生物可以形成菌落，而每个单一菌落常常很可能是由一种个体繁殖而成。不同微生物的菌落是可以识别和加以鉴定的。因些将样品中不同微生物个体在特定的培养基上培养出不同的单一菌落，再从选定的某一所需菌落中取样，移植到新的培养基中去，就可以达到分离纯种的目的。这也就是常用纯种分离法的原理。

在微生物的分离和纯培养过程中，必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作，就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器或系统内，从而污染培养物。具体操作方法见本实验有关部分和教师作示范。

获得微生物纯培养的常用方法有稀释平板分离法和平板划线分离法等。有条件的单位也可用显微操纵器单细胞分离法。针对不同的分离材料和条件，可以采用不同的分离方法。

一、目的要求

1. 初步掌握微生物的分离、培养和菌种保藏的基本方法。

2. 练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。

二、实验材料

样品：新鲜土壤。

培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基（10mL装）。

无菌水：带有玻璃珠装有45mL无菌水三角瓶、装有9 mL无菌水的试管。

其它：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、台天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、胶水、水泡锅。

试剂：5000U/mL链霉素液

0.5％重铅酸钾液。

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三、实验程序

（一）微生物的分离

1. 用稀释平板法（又名混菌法）从土壤中分离真菌。

（1）制备土壤稀释液

无菌操作过程

A. 取土壤5g，放入装有45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10-1的土壤悬液。

B.另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取 1mL土壤悬液加入10’的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法由10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6土壤稀释液。

在土壤稀释过程中，以用一支吸管由浓到稀，稀释到底，稀释方法见图7-1。

图7－1 检样的稀释方法

（2）每组取无菌培养皿2付

①先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。

②取另一吸管，以无菌操作法吸取10-4或10-5土壤稀释液1mL，加在无菌培养皿的一边，在皿的另一边加入 2滴 5 000U/mL的链霉素液。此时严防两液相混。

③取已融化在水浴锅中保温50oC左右的马铃薯蔗糖琼脂培养基2管（10mL装，一管倒一皿），以不烫手为准，倒入上述培养皿中（见图7-2），轻轻转动培养皿，使菌液、链霉素液、培养基充分混匀铺平皿底，放在平坦的桌面上，凝固后，翻转培养血，置28～30oC恒温培养养5~6d。观察真菌菌落形态以及计数菌落数。并计算出每1g土壤中真菌的数量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。

（3）挑取单个菌落接种到外面培养基上作纯化和性能测定，若不纯，需要继续分离。

图7－2 倒培养基平板a. 皿加法b. 手持法

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第2楼2011/05/04

2. 用平板涂抹法分离土壤中的放线菌（土壤稀释液制备同上）。

①每组取无菌培养皿2付。各在培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度。

②以无菌操作法先在培养皿中加入0.5％重铅酸钾溶液2滴，取已融化的淀粉琼脂培养基2管，分别倒入2付培养皿中，轻轻转动培养皿，使培养基与重铅酸钾充分混匀，铺平，制成平板。

③待平板凝固后，另取一支吸管吸取10-3或10-4稀释液0.2mL土壤稀释液放在平板上。

④取无菌三角玻棒，把上述稀释液在平板表面涂抹均匀（见图7-4）。在涂抹时不要弄破平板，以免影响菌落的生长。翻转培养皿，置28℃~30℃条件下培养6~7d，观察放线菌菌落形态及计数菌落，并算出每g土壤中放线菌的数量（方法同上）。

⑤挑取单个菌落，接种于相应的斜面培养基上，如果不纯再移植或纯化，直至得到纯培养为止。

图7－3 吸管吸取菌液图7－4 平板涂抹操作

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第3楼2011/05/04

3. 用平板划线法分离土壤中的细菌（土壤稀释液的制备同上）。

（1）每组取无菌培养皿两付，同上法在培养皿底部贴上标签。取已融化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入无菌培养血中，制成平板。

（2）平板凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10-5或10-6）在平板上划线
①连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划法（图7-5），勿划破培养基。划线完毕后，倒置28oC～30oC温室培养。

②分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在平板培养基的一边作第1次平行划线3-4条，再转动培养皿约60”角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线（见图7-5）划线完毕，盖上皿盖，倒置于28℃-30℃温室中培养。

（3）挑取单个菌落接种子斜面培养基上，如果不纯再移植成纯化，最后得到纯培养。

用上述分离土壤中真菌、放线菌和细菌的方法，也可用于分离病虫、病蚕或果蔬上的病原菌。以划线法从病蚕分离黑胸败血病病原菌为例，先用75％酒精棉球进行表面消毒（注意病虫、病蚕、果蔬等分离的样品不要过份腐烂，便于进行材料的处理。取灭菌手术剪剪去病蚕的一只腹足，流出体液作为划线分离的材料，若是分离苹果炭疽病病原菌，则用无菌镊子揭下有炭疽病苹果的果皮，再从此处切取米粒大小果皮1块，放入盛有1mL无菌水的试管中，用无菌玻棒捣碎制成悬浮液，划线法分离病原菌。

图7－5 平板分离划线的方法
A. 连续划线法B. 分区划线法

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第4楼2011/05/04

（二）微生物的接种方法（示范）

（1）接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、试管深层固体培养基的穿刺接种法等。

（2）接种工具见图7-6所示。

图7－6 常用的微生物接种工具
a. 接种环b. 玻璃括铲1. 塑料套2. 铝柄3. 镍铬丝4. 接种针5. 接种钩6. 接种环7. 接种圈8. 接种锄9. 三角形括铲10. 平括铲11. 移液管12. 滴管

①接种针（白金耳）

接种针、接种环和接种钩，以往通称白金耳。最早都用白金丝制作，但因价格昂贵，现多用500-1000W镍铬合金电炉丝制作。

接种针长度为8cm左右，呈直线状．固定在长约20cm的金属柄及竹柄或塑料柄上。用于固体培养基穿刺接种。

②接种环

在接种针的一端卷成一园环，直径2mm左右。用于细菌和酵母菌及有孢子的放线菌及霉菌的接种，用于液体接种及划线接种，也可用来定量稀释菌液。

③接种钩

在接种针的一端弯成一个直角，顶边长约3mm常用于沾取微小菌落的培养物进行移植时之用，以及放线菌及霉菌的接种。

④接种圈

将接种针的末端卷起数圈成为盘状。专用于砂土管中移植菌种。

⑤接种铲或接种锄

用不锈钢细钢丝将末端砸扁成刀刃，即成接种铲，或将接种针的末端弯曲成双折并紧如接种钩，双折部分再弯成90o直角，最后把里侧砸扁，磨薄成刀刃，即成扁锄形。用于刮取真菌菌丝和孢子等。

接种铲用于切取真菌菌丝，如食用真菌的接种，效果最佳。

⑥玻璃涂棒

用直径3-5mm，长约20cm的普通玻璃棒，在喷灯火焰上把一端弯成三角形。用于抹的一边要求平滑，否则涂抹不均匀。同时前端方面应稍向下方倾斜便于操作。

微生物的接种一般在接种室、接种箱、净化工作台中进行。接种室、接种箱、净化工作台在接种前须用紫外线或化学药剂进行表面杀菌。接种时需进一步用火焰来杀菌，才能达到无菌操作的目的。

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第5楼2011/05/04

1. 斜面接种法

斜面接种方法及无菌操作过程如下具体操作过程见图7-7。

图7－7 斜面接种无菌操作示意图

（1）左手平托两支试管，拇指按住试管的底部。外侧一支试管是斜面上长有菌苔的菌种试管，内侧一支是待接的空白斜面，两支试管的斜面同时向上。用右手将锦塞旋松，以便在接种时容易拔出。

（2）右手拿接种环（如握毛笔一样），在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌．

（3）将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指和掌心将两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。注意不得将棉塞随意丢于桌上受到沾污，试管口切勿烧得过烫以免炸裂。

（4）将已灼烧的接种环伸入外侧的菌种试管内。先把接种环的先端触及无菌苔的培养基上使其冷却（如果操作迅速，此时接种环尚未完全冷却）。再根据需要用接种环沾取一定量的菌苔，注意勿刮破培养基。将沾有菌苔的接种环迅速抽出试管，注意勿使接种环碰到管壁或管口上。

（5）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管的底部，轻轻向上划线（直线或曲线，根据需要确定），勿划破培养基表面。

（6）接好种的斜面试管口再次过火焰，棉塞底部过火焰后立即塞入试管内。

（7）将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在内焰中烧灼，使其干燥后，再在外焰中烧红，以免菌苔骤热，会使菌体爆溅，造成污染。

（8）放下环后，再将棉花塞旋紧，在试管外面上方距试管口2～3cm处贴上标签。

（9）28℃～37℃恒温培养。

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第6楼2011/05/04

2. 液体接种法

包括从外面菌种接人培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种，同时要求无菌操作。

3. 穿刺接种法

用接种针经火焰灭菌，沾取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后沿着原接种线将针拔出，见图7－8。要做到手稳、动作轻巧快速，最后塞上棉塞。再将接种针上残留的菌体在火焰上烧掉。

图7－8 穿刺接种的2种方法
a. 垂直法b. 水平法

（三）微生物培养中的氧气条件

参观培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵——摇床、厌氧培养罐等。

根据培养微生物时所控制的氧气条件，可将培养的方法分为好氧培养法和厌氧培养法。真菌、放线菌和大多数细菌都是用好氧培养。厌氧性细菌则相反，要求进行厌氧培养。

1. 好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。

2.厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并用的方法。厌氧培养罐（图7-9），以某种气体取代培养容器中的空气，并添加还原剂。如产气袋法和换气法。在进行厌氧培养时，可以用指示剂检查培养系统中的还原条件，一般实验室中常用的如葡萄糖——美兰指示剂。

美兰氧化还原指示剂配方：

NaOH0.006N

0.015％美兰溶液

6％葡萄糖溶液

上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，迅速放入厌氧罐中。

几种普通的厌氧培养法介绍如下：

（1）生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入发芽的种子，因种子的呼吸作用增强吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。

（2）化学方法利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气。在容器的一边放一包用吸水纸包好的焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，两者反应时吸收容器中的氧气，创造厌氧条件。反应式如下：

100mL容器中需用10％NaOH溶液10mL，焦性没食子酸1g。

此法的缺点是，因为这个反应是在强碱性的环境中进行，因此容器中的CO2也被吸收了，故对于某些需要CO2 的微生物，此法不适用。

（3）物理方法：方法很多，常用真空泵抽出密封干燥器内的空气或再充入其它惰性气体，以保证厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培养物。一般为达到严格厌氧目的，常采用物理和化学相结合并用的方法。

图7－9 厌氧培养罐图7－10 厌氧培养装置
1. 连接真空泵2. 隔板3. 吸氧剂

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第7楼2011/05/04

）四大类微生物菌落形态的比较和识别

在分离和纯化微生物之前，首先必需对四大类微生物的菌落形态有正确的比较和识别，即细菌、酵母菌、放线菌和霉菌。熟悉和掌握这四大类微生物的形成特征对于菌种的筛选，杂菌的识别和菌种的识别都有很大用处。

区分和识别各大类微生物通常不外乎包括菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形成）等两方面的观察。细胞的形态构造是群体形态的基础，群体形态则是无数细胞形态的集中反映，故每一大类微生物都有一定的菌落特征，即它们在形态大小、色泽透明度、致密度和边缘等特征上都有所差异，一般根据这些差异就能识别大部分菌落。

四大类微生物菌落的基本特征可以从下面几占大概地把它们区分开来，更详细的可参考表7-1，作进一步的加以对照。

菌落形态
细菌	菌落表面湿润，薄而小
酵母菌	菌落表面湿润，厚而大
放线菌	菌落表面干燥，密而小
霉菌	菌落表面干燥，松而大