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第1楼2013/08/16
Limuhs—测试法用于革兰氏阴性菌脂多糖 的测定。这种方法可以在30分钟—1小时内定量测 定食品中存在的死去的和活着的革兰氏阴性菌的 细胞壁组成部分。这种测定法是使用剑尾蟹 (Limulus polyphemus)的变形细胞的溶菌产物来进 行的。剑尾蟹的血液被革兰氏阴性菌浸染时会发 生凝结,这是由于细菌的细胞壁组分(脂多糖)和变 形细胞之间出现丁胶凝作用,变形细胞是一种剑 尾蟹血液中特有的血细胞,它含有酶原和凝集酶, 当存在脂多糖时,酶原被激活,进一步与凝集酶反 应发生胶凝作用。内毒素的鉴别就是根据胶凝作 刚进行的,因为内毒素与革兰氏阴性菌含量呈线性关系,所以可以根据革兰氏 阴性菌的污染程度确定内毒素的含量。
这个方法可用于食品中内毒素的快速检测,特别是新鲜易腐败的如牛奶、肉、鱼和蛋等食品,因为这些食品上的细菌多为革兰氏阴性菌。此方法还用于鉴定加工食品原料中革兰氏阴性菌(包括死菌在内)的含量,蛋白制品的卫生细菌学质量检测、肉类食品的细菌学质量检测,以及医学范围内的注射液质量检测等多个方面。
ATP测定法是利用生物发光法,应用荧光素—荧光素酶制剂进行的,在活细胞中ATP含量近乎是恒定的,利用特殊的酶试剂水解掉细菌膜,使ATP释放,ATP与荧光素—荧光素酶制剂反应变成AMP和光,产生的光强度与ATP成正比,通过测定光强度可确定细菌浓度。这咱方法可用于鲜肉、鲜鱼、牛奶、啤酒、矿泉水以及无菌药品的检测等多种领域。
ATP+荧光素+荧光素酶(Mg2+)→荧光素→荧光素酶→AmP+焦磷酸
荧光素→荧光素酶→AMP(O)→氧化荧光素+荧光素酶+AMP+CO2+光
直接表面荧光过滤技术,是将含菌产品制成过滤的食品均质液,经核孔一多聚碳化物膜过滤后,用吖啶橙染色效果不好,添加荧光增白剂天来宝(Tinopal),可以使模糊菌像变为可见,染色的菌发出的荧光从绿色、橙黄色到红色。检测时间为20-30分钟。
总菌数/毫升=滤膜面积×计数菌落的算术平均值/视野面积×样品值
氧气消耗测定法建立在密闭系统中连续极谱氧气测量的基础上,在密闭系统中微生物的低谢值越高,液体样品一培养基中氧气消耗越快。在25℃条件下的氧气测定室中,检测含菌数在104~107/ml的牛奶食品,大约1小时可以得出结果。
食品微生物快速 检测法在加外发展非常迅速、普遍,而在国内应用较少。希望通过介绍这些较新的方法,能够对食品微生物工作者有所启示,对国内食品微生物检验方法结果对食品生产更有指导意义。
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第2楼2013/08/16
补充一下,供大家讨论。
1 分子生物学方法,direct-PCR, 滚环PCR,bio-PCR,nest-PCR, IC-PCR(免疫捕捉PCR)、IMS-PCR(免疫磁珠PCR),这些检测方法可在最多4个小时内,将致病菌检测到种,这些方法的特点是检测灵敏度很好,一般情况下检测体系中有100个细菌,就可以检测出来,另外无需DNA提取,直接在PCR之前,加一个94度的高温20分钟,让细菌裂解并释放DNA作为模板就可以了,但实验室必须有PCR条件,且操作技术相当熟练。
2 免疫学方法,ELISA检测方法,对于大规模的初步样品筛查,非常的适用,也是国外最常用的快速检测技术,但是遗憾的是由于食源性致病菌单克隆抗体的制约,我国没有自主生产的ELISA试剂盒,国外进口极其昂贵,96孔板检测试剂盒售价高达5000-6000元,检测成本实在是太高了,我目前无法普及,但是未来普及此检测技术,只是迟早的事情。该方法检测灵敏度在105-106cfu/ml,比分子方法低一点,但是检测通量很高。
3 分子+免疫学,就是用特异性抗体先富集确认,之后直接进行PCR扩增,比如IC-PCR(免疫捕捉PCR)、IMS-PCR(免疫磁珠PCR),这些方法并不流行,但是非常非常的实用,因为这些检测方法经过了免疫学识别和富集,PCR分子水平的检测确认,双重确认,检测结果非常准确。
总之,根据我们的经验,现有的方法都挺好,其实最关键的是如何在复杂的样品中富集到有效病原,病原拿到了,什么方法都能检测出来。另外,如果能免去预增菌过程,那么才叫真正的快速检测,要免除预增菌,膜过滤是一种最经济实用的方法,但是现在的滤膜用0.45um孔径,有点偏大,很多细菌比这个小,会漏检的。我们用0.22孔径滤膜,可以有效的将细菌富集起来去检测。
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第3楼2013/08/16
1 传统生物学方法,按照标准检测,最麻烦,最传统,但是最经典,可作为其他方法之验证。
2 显色培养基方法,用国外进口显色培养基检测,比较方便,目前最流行,使用简单,也不贵。
3 胶体金试纸条检测,购买国外进口试纸条,现场检测,这种方法10分钟可以检测到结果。但是检测灵敏度偏低。
4 ELISA,酶联免疫实验。目前只有国外进口,欧美四家大公司垄断了全球95%以上的市场,一个96孔试剂盒,售价高达5000-6000元,非常无奈,但是是国外最流行的快速筛选技术,检测灵敏度、检测周期都比较理想,不过国内现在有公司专业在做这方面的试剂盒了,估计价格很快会降下来,可能是将来主流的检测技术了,部分已经写进国标了。
5 IC-PCR,免疫捕捉PCR,用抗体特异性识别捕捉,之后再PCR扩增。最大的优势是,病原经过抗体识别、PCR检测双重检测,可一次鉴定到种,检测灵敏度可以达到十的两次方,不用核酸提取,所有反应在一个PCR管里进行,减少了病原的损失,缺点是检测时间大致在4个小时,是一张理想的验证手段。
6 Direct-PCR,增菌后直接PCR,比较简单的验证手段,增菌后直接扩增,受PCR检测体系的现实,灵敏度偏低,但是取决于样品中的菌含量。
7 Nested-PCR,两对引物巢式PCR。两对引物两次扩增,最大的优势是检测准确性、灵敏度可绝对保障,劣势是检测时间较长。
8膜过滤PCR,利用病原富集装置,富集之后检测,最笨的一种方法,但是是最实用的,病原经过微孔滤膜过滤后,可高效富集病原 ,之后去检测,大大提高检测灵敏度。
9 BIO-PCR,培养增菌后PCR扩增,这个技术只能做研究用了,就是分离培养后,用PCR检测,乏善可陈。
10 IMS-PCR,免疫磁珠PCR,用免疫磁珠捕捉,之后进行PCR,用磁珠富集样品中的病原,之后直接PCR扩增,非常实用的方法,主要是可以富集病原。
11 BAX快速检测系统,按照系统说明书操作。贵族实验室用的东西,灵敏度和其成本、假阳性一样出色。
12 RiboPrinter快速检测系统,按照系统说明书操作。同上,大同小异。
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第4楼2013/08/16
国标里用的血清学不是用来快筛,而是用来血清分型,是对生化鉴定结果从另一种检测原理上进行实验补充和确认。食品标准里面很少用快筛方法进行菌株确认,我见过的只有加拿大的Health Care、US FDA BAM肯定了一点点,药典里面倒是肯定了分子生物学方法。
免疫方法是否落伍我不敢说,但从国际上食品致病菌检测技术发展、实际应用效果来看,免疫学技术遇到了一个瓶颈:包容性、排他性性能越来越被新的技术超越(AFNOR认证实验总结中有详细的实验过程和结果)。免疫学的单抗较多抗是一大飞跃,排他性性能得到了极大提高,随之而来的是包容性的挑战。这是一个矛盾的2面,因为要找到目标菌的各菌株都带有的特异抗原太难了,也或者事实上大多数致病菌就不存在这样独一无二的抗原。从检测要求来看,包容性不足更影响检测方法可信度,所以免疫法产品就用多个单抗来弥补这个不足,虽然会带来一些排他性性能的降低(即产生部分假阳性结果)。从厂家角度来看,能做到进口高质量品牌产品持平的性能,同时做到国内可接受的价位,这就是成功之路。需要考虑的是这个市场能维持多长,毕竟新技术产品也在不断平民化(最近我比较关注3M公司的分子生物学产品,从资料上来看它应当是用了日本人发明的LAMP技术,仪器很便宜、很简单,就看它是否能克服LAMP原来的问题。国内华南理工也在开发这种技术)。
采用哪一种方法检测产品完全靠检验人员的技术水平。快筛产品在一些真的很有经验的老师眼里不上位,任何问题他们自己就搞掂了。可是到哪里去找那么多高水平的检验人员?检验的效率如何保障?好钢用在刀刃上,人员技术结合快检方法才能解决问题,用好快检方法才能解决问题,快检方法解放技术人员的大脑,让他们有时间来考虑疑难问题的解决方法。比如对于快检方法的阳性样品,如何通过简单地增加一些检验步骤快速地进行二次排查。
如何跨越式发展,广播里听得多了,可见到的不多。任何技术都要经过长时间的积累,PCR技术从发明到食品检测上的实用也有十几年,AOAC到2003年才承认了第一个PCR产品。前车之鉴总归会有一些意义,没有突破性的技术成功的机会难以把握。苹果公司的iPhone能从诺基亚手中夺过智能手机的宝座,不是跟从,而是革命。
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第5楼2013/08/16
食品标准里面很少用快筛方法进行菌株确认,血清学是为了分型,对标准及第一线检测不甚了解,血清学和酶联免疫技术,不是同一个概念,血清学就是最早的玻片凝集实验,而ELISA纯粹是一个检测手段,国标里面,早就有几个标准,同时将ELISA、pcr纳入标准里了,上海出入境检验检疫局参与制定的,伙伴网里面就能下载,你看一下就知道了,更不用说大量的行业标准里面的快速检测技术。艾滋病检测,就是用两种方法的检测,免疫学初筛,PCR、western确认,在未来的国标里面,还会有大量的快速检测技术出现,但是,没有一个能离开免疫学这一快速检测技术的金标准,这个所有做检测的人,都不会否认的。
准确到某个种,比如沙门,志贺,确实对抗体提出了挑战,但是就如你所说,快速检测,是一个初筛的技术,ELISA完全符合这个特点,食品检测中,怎么可能把没有在国标中,在国内普及的技术,完全放弃掉呢?
包容性,排他性,抑制用于对大型进口设备封闭型试剂的描述比较合适,用于抗体的描述好像不合适,也非专业词语。谢谢!免疫学技术出现几十年来,已经遍布各个检测领域,起码在未来的10年内,仍然是快速检测主流技术,要说有革命,那就是芯片了,但是蛋白芯片,仍然离不开抗体。