邻甲苯胺及其同分异构体的分离
The Separation of O-Toluidine and Its isomers
摘要：为了实现邻甲苯胺及其同分异构体的完全分离，首先，作者将邻甲苯胺及其同分异构体乙酰化，然后采用气相色谱-质谱联用方法，通过改进色谱条件，使其取得了完全分离。试验表明采用气-质联用方法可以实现邻甲苯胺及其同分异构体的完全分离。
关键词：邻甲苯胺；分离；异构体；乙酰化
Abstract: In order to achieve the complete separation of o-toluidine and its isomers, firstly, o-toluidine and its isomers were acetylation, and then the authors used gas chromatography-mass spectrometry methods, by improving the chromatographic conditions, so as to achieve their completely separation. The results showed that the gas-chromatography-mass spectrometry method can achieve the completely separation of o-toluidine and its isomers.
Keywords: o-toluidine; separation; isomers; acetylation
1 前言
在禁用偶氮染料检测过程中，邻甲苯胺是经常被检出者之一。邻甲苯胺有两个同分异构体，分别是间甲苯胺和对甲苯胺。其中，邻甲苯胺属于禁用芳香胺，而间甲苯胺和对甲苯胺则不属于禁用芳香胺。三个化合物的沸点非常接近，分别为：邻甲苯胺（200±2℃）、间甲苯胺（203±3℃）、对甲苯胺（201±1℃）。而且三者的质谱图很相似，只是分子极性上略有差别，故造成在用气相色谱-质谱联用方法检测到邻甲苯胺时经常出现假阳性结果。如不采用薄层色谱、液相色谱等其它分析手段共同鉴别，是无法判断是否假阳性结果的。但是要排除假阳性结果，就需要重新寻找条件，而且更换仪器费时费力，且多数实验室不一定同时具备这些设备，这就给我们的日常检测工作带来了很多的麻烦和不便。
本文作者结合自身知识和经验，对常见的邻甲苯胺及其异构体分离问题进行了研究。通过查阅相关资料，作者发现邻甲基乙酰苯胺（296℃）、间甲基乙酰苯胺（303℃）和对甲基乙酰苯胺（307℃）三者的沸点相差较大，所以作者首先通过试验将邻甲苯胺及其异构体分别乙酰化，然后通过改进色谱条件，使以上化合物达到了完全分离，提高了检测效率，减少了检测过程中的假阳性检出。
2 试验
2.1 仪器与试剂
气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）：Agilent 7890A/5975C，美国Agilent公司
毛细管柱：DB-17MS柱（30m×0.25mm×0.25μm）
叔丁基甲醚、乙酸酐、无水碳酸钠和无水碳酸钾均为分析纯
旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂
邻甲苯胺及其同分异构体均为德国Dr.Ehrenstorfer公司。
2.2 试剂配制
标准品溶液：用叔丁基甲醚为溶剂，分别称取适量邻甲苯胺、间甲苯胺和对甲苯胺标准品配成合适浓度的单标溶液及混合溶液。
碳酸钾溶液：0.1mol.L-1水溶液，取13.8g无水碳酸钾溶于水中，定容至1000ml。
2.3 仪器操作条件
色谱柱：DB-17MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；温度：进样口220℃；辅助器280℃；离子源230℃；四极杆温度：150℃；柱温：60℃保持1 min，以15℃/min升温至200℃，保持0min，再以20℃/min升至310℃，保持5 min；载气：He；流速：1.0mL/min；离子化方式：EI；质量扫描范围：35~350；进样方式：不分流进样；进样0.2μ L。
2.4 邻甲苯胺及其异构体的乙酰化
取0.1mol.L-1的碳酸钾溶液50ml于150ml分液漏斗中，加入5ml配好的已知浓度的邻甲苯胺单标溶液，再加入2ml乙酸酐溶液，振摇5min，弃去下层，上层溶液转移至10ml离心管中，加入2g无水碳酸钠振摇1min。取上层清液供气-质联用仪检测用。
同理，间甲苯胺、对甲苯胺和其混合溶液都按上面的操作乙酰化。
3 结果与讨论
3.1 试验结果
（1）未乙酰化的邻(间、对)甲苯胺总离子流图
图1 未乙酰化邻(间、对)甲苯胺单标及混合物总离子流图
A：邻甲苯胺总离子流图；B：间甲苯胺总离子流图；C：对甲苯胺总离子流图；
D：邻（间、对）甲苯胺混合物总离子流图
由图1可以看出，邻甲基苯胺及其异构体在本实验条件下，单标保留时间分别为：邻甲基苯胺(7.046min)；间甲基苯胺(7.099min)；对甲基苯胺(6.987min)。而三者的混合物保留时间分别为：邻甲基苯胺和对甲基苯胺(7.009min)；间甲基苯胺(7.073min)。由于邻甲基苯胺和对甲基苯胺保留时间太接近而无法有效分离，所以在该实验条件是无法保证假阳性结果的排除。
（2）乙酰化后邻(间、对)甲苯胺总离子流图
图2乙酰化后邻(间、对)甲苯胺单标及混合物总离子流图
A：乙酰化后邻甲苯胺总离子流图；B：乙酰化后间甲苯胺总离子流图；
C：乙酰化后对甲苯胺总离子流图；D：乙酰化后邻（间、对）甲苯胺混合物总离子流图
由图2可以看出，乙酰化后的邻甲基苯胺及其异构体在本实验条件下，单标保留时间分别为：邻甲基乙酰苯胺(11.208min)；间甲基乙酰苯胺(11.672min)；对甲基乙酰苯胺(11.732min)。而三者的混合物保留时间分别为：邻甲基乙酰苯胺（11.189min）；间甲基乙酰苯胺(11.665min)；对甲基乙酰苯胺(11.740min)。显然，在该实验条件乙酰化后的邻甲基苯胺及其异构体实现了完全分离。
3.2讨论
在对纺织品禁用偶氮染料的测定过程中，由于异构体的存在，并且多数异构体的质谱图很相似，如果保留时间再相同，往往会形成假阳性结果的产生。当前针对有害芳香胺的气相色谱/质谱检测方法，大多采用非极性色谱柱[1-4]，如HP-5MS，DB-5MS，这些色谱柱普遍存在的缺点是对常见的芳香胺异构体不能很好的分离。本方法通过使用中等极性色谱柱DB-17MS(固定相等同于50％苯甲基聚硅氧烷)，同时使用三阶程序升温，尝试了很多升温程序，虽然实现了间甲苯胺与其它两种异构体的分离，但是邻甲苯胺和对甲苯胺因保留时间太相近而无法实现有效的分离，这对分析结果假阳性的排除没有任何帮助，所以作者认为，使用中等极性色谱柱DB-17MS无法实现对邻甲基苯胺及其异构体的完全分离。
作者查阅相关资料发现，邻甲基苯胺及其异构体乙酰化后的产物沸点分别为：邻甲基乙酰苯胺（296℃）、间甲基乙酰苯胺（303℃）和对甲基乙酰苯胺（307℃）。三者的沸点差异较之未乙酰化前有了很大的变化。于是，作者参考相关资料[5]对邻甲基苯胺及其异构体的乙酰化条件进行了实验，分别研究了不同振荡时间对反应的影响，以气-质联用仪检测反应结果，以乙酰化后产物的积分面积占未反应完的邻甲苯胺及其异构体和乙酰化后产物积分面积和的百分比为反应产率。结果如下：
表1 不同振荡时间对邻甲基苯胺及其异构体的乙酰化产率的影响
物质名称 | 不同时间的反应产率/% |
2min | 3min | 4min | 5min | 6min |
邻甲苯胺 | 70 | 85 | 96 | 100 | 100 |
间甲苯胺 | 65 | 80 | 95 | 100 | 100 |
对甲苯胺 | 65 | 81 | 95 | 100 | 100 |
由表1可知，本实验乙酰化最佳反应振荡时间为5分钟。
本文通过先将邻甲苯胺及其异构体乙酰化，然后利用气-质联用仪，使用中等极性色谱柱DB-17MS(固定相等同于50％苯甲基聚硅氧烷)，同时使用三阶程序升温，实现了邻甲基乙酰苯胺、间甲基乙酰苯胺和对甲基乙酰苯胺三者的完全分离。本方法对只有GC-MSD而没有HPLC-DAD的实验室定性工作有很大的帮助，可大大降低GC-MSD法检测结果中假阳性结果的检出，从而提高了分析结果的准确性，同时节约了检测时间提高了检测效率。
作者通过大量的试验证明，该方法快速、精确、重现性和稳定性好，具有很高的可行性和可靠性。
4 结论
由前文分析可以得出如下结论：
a) 该方法实现了邻甲基乙酰苯胺、间甲基乙酰苯胺和对甲基乙酰苯胺三者的完全分离，对只有GC-MSD而没有HPLC-DAD的实验室定性工作有很大的帮助，可大大降低GC-MSD法检测结果中假阳性结果的检出，从而提高了分析结果的准确性，同时节约了检测时间提高了检测效率。
b)该方法快速、精确、重现性和稳定性好，具有很高的可行性和可靠性。
虽然因为衍生化会于邻甲苯胺的定量结果会产生较大的影响，但是，如果操作控制得当，定量结果的影响不会太大，所以该方法仍然具有很好的推广和应用价值。
参考文献
[1] GB/T17592-2006,《纺织品 禁用偶氮染料的测定》.
[2] 杨继生，徐逸云，蒋华.对纺织品禁用偶氮染料检测方法的探讨[J].印染.2005,06:37-39.
[3] 康云. 禁用偶氮染料检测中的若干问题[J].中国纤检.2005,8:24-25.
[4] 胡小钟，余建新等.禁用偶氮染料检测中假阳性结果的鉴别方法[J].分析化学研究报告.2000，28(4):411-416.
[5] GB/T18414.1-2006 《纺织品 含氯苯酚的测定 第1部分：气相色谱质谱》.
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