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悲催的离子抑制，我拿什么来消灭你

happy爱米粒

2011/08/04

液质联用（LCMS）

悲催的离子抑制，我拿什么来消灭你！

6490仪器方法移植完成后，方法验证时仪器只进了几个项目的日常检测样品，主要是高敏感项目，呋喃、氯霉素、激动剂，因为都用内标定量，所以检测目标物浓度与Premier相差不大。

MassHunter软件不能自动计算内标浓度，所以对基质内标回收率的监控就不方便了很多，后来在准确性验证的过程中发现空白和基质氯霉素内标回收率很低，是premier的20%，由此，陆续发现呋喃、磺胺等外标定量的化合物也出现了类似的问题，定量结果偏低。

分析：

离子的形成与传输效率是影响化合物灵敏度的关键，于是进行了以下试验
1、向阴性基质中加入标准物质与纯溶剂中的标准物质响应作比较，检查发现部分项目灵敏度下降很多，化合物极性强度不一。

fig 1 基质标定、基质回收率与纯溶剂标准品比较

2、对基质加标溶液进行降低进样量和稀释进样两种处理办法进样，灵敏度均较原基质溶液有明显提升，但是在进样目标物绝对质量相同的情况下，进样体积小的灵敏度比大体积进样提升的更明显。

fig 2 降低进样量基质标定、基质回收率与纯溶剂标准品比较

fig 3 多种基质降低进样量后内标回收率及阳性结果与premier比对

fig 4 降低进样量和稀释大体积进样结果比对

3、标准物质的灵敏度正常，梯度稀释呈线性。

通过上述实验基本确定预处理过程引入的试剂和基质中的干扰成分产生的离子抑制影响了目标化合物的电离。

离子抑制是基质效应的一种，基质效应一般源于待测组分与生物样品中的基质成分在雾滴表面离子化过程中的竞争。由于基质中某些干扰组分的存在会使待测组分离子生成的速度同标准样品相比有显著不同，使得信号响应值产生较大变异。还有一种可能是由于待测组分与基质中内源性物质共洗脱而引起的色谱柱超载所致，这些成分常因在色谱分析中与目标化合物分离不完全或未被检测到而进入质谱后产生基质效应。

根据不带基质的全程空白内标回收存在严重的离子抑制，分析该效应应源于待测组分与预处理试剂中的干扰成分在雾滴表面离子化过程中的竞争，因此离子源参数设置的好坏直接决定了离子抑制的严重程度，而基质中的干扰组分则可能和目标物共流出产生了离子抑制。

离子抑制的解决方案

1、ESI离子源参数优化

之前的premier拥有多年的使用经验，离子源的各个参数几乎都被优化到了极致，而开始做6490仪器方法移植的时候，项目较多，时间紧迫，只能将重点放在优化子离子碰撞能量上，源参数大多使用的默认设置，心想顶多影响点离子化效率，不影响做方法，所以应该有很大的完善空间。但是同样的小瓶、同样的色谱柱、同样的梯度洗脱在不同的设备上检测结果差别这么大，还是让我们对6490产生了“怀疑”，于是我们对premier和6490进行了比较，努力寻找其离子源原理和结构上的异同点。

fig 5 premier和6490离子源参数比对

在弄清楚了两家仪器的离子源构造，更好的理解各参数的意义的情况下，着手进行源参数的优化。既然是针对全程空白的基质效应，那就使用加了内标的全程空白分别对各个重要源参数进行优化，主要包括毛细管入口电压、喷嘴电压、干燥气温度、干燥气流速、雾化气压力、鞘流气温度和鞘流气流速，其中毛细管电压是最为关键的因素，不同分子量的化合物电离需要的毛细管电压不同，一般分子量大的所需的电压较高。而如果干扰离子质荷比与目标化合物相差较大，可以通过调节毛细管电压抑制其电离。

fig 6呋喃代谢物内标离子源参数优化

经过优化，不仅全程空白的内标回收率上来了，目标化合物的灵敏度也提高了不少，似乎预处理试剂引入的干扰被解决了，接下来就是解决基质干扰的问题了。

2、液相分离干扰物质

优化离子源参数不能解决基质干扰问题，从源头优化样品预处理方法也不太现实，只能调整色谱保留时间将干扰物质和目标物有效分离。为了证明梯度条件的必要性，在Premier上采取基质加标自动进样和直接在质谱接口手动进样两种方式同时进行，比较离子流强度，同步做纯溶剂标准品试验，证明没有梯度条件的电离确实存在明显的基质效应。

Fig7 premier基质加标自动进样和直接在质谱接口手动进样灵敏度比较

于是我们尝试着换了一根色谱柱（T3换成C18），目标化合物保留时间延后，惊喜发现内标回收率恢复正常，推断杂质和目标物得到有效分离。于是又重新换回T3柱，为了避开基质组分的干扰，将所有化合物的出峰时间都拖到了3分钟之后，并通过回收率样品和基质效应样品在不同色谱条件下的响应的比较寻求最佳分离条件。虽然因保留时间延后损失了一些灵敏度，但基质干扰基本消除了。

Fig8 优化梯度洗脱条件过程氯霉素内标回收率数据比较

Fig9优化梯度洗脱条件过程氯霉素内标谱图

然而优化梯度条件的过程是非常痛苦而漫长的，有时候调整一上午都不能达到理想的效果。有时候终于满足要求了，却延长了保留时间损失了样品通量。当初为了提高效率，将waters的色谱柱直接拿来，通过调整流速使用相同的洗脱条件，实现了相同的保留时间，本以为万事大吉，现在看来，远非如此啊。

可是我始终无法理解，为什么当初用premier做方法验证时仪器没出现这么严重的基质效应？似乎随便一个简单的梯度洗脱就可以摆脱基质干扰了。根本原因应该还是和硬件构造，尤其是离子源设计有关吧？呵呵。

通过这次离子抑制的消除过程，我总结了以下几点经验：

1、准确性考察时，内标和外标定量两者要兼顾，更全面的验证以便及时发现问题。

2、不同的仪器不同的液相系统应了解其系统死体积和延迟体积，科学设置梯度洗脱条件。

3、在进行方法准确性的验证时，对于质谱检测，特别是ESI电离源，一定要对基质效应的影响进行评估，方法很简单，只要向基质和纯溶剂中加入标准品比较其灵敏度即可。

4、还有一种基质正效应即离子增强，在方法验证时发现部分非质子加合峰，如聚醚类药物、阿维菌素类药物等加钠峰容易出现基质正干扰，应在预处理时尽可能增加净化步骤，并使基质溶剂与流动相保持一致。

5、书到用时方恨少，理论知识的储备也很重要，基质效应对ESI离子化方式影响尤为显著。我发现自己对电喷雾电离了解的太少了，解决问题的时候显得有些盲乱。可能平时做应用久了，于是趁此机会便恶补了一下电喷雾电离的基础知识。

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胜邪

第1楼2011/08/04

楼主做的够细啊，我通常走完样发现有基质效应或化合物竞争电荷就液相分离。
开始阶段的柱后灌流也用，很少。
向勤快的楼主学习！

0

论坛版主招募|新窦

第2楼2011/08/04

premier的离子抑制效应没有A的强吗？挺困惑的，可能跟离子源的设计有关系，waters的相当多的样液都吹掉了，只有一小部分进入到QQQ里。
之前一直认为离子抑制只能通过预处理使样液更干净来解决，原来优化源参数也能收到效果。

0

dahua1981

第3楼2011/08/04

应助达人

离子抑制不好控制啊，有时候是体系不得不加入的

0

胜邪

第4楼2011/08/04

第一次遇见调节源参数，改善基质干扰啊。

1

happy爱米粒

第5楼2011/08/04

优化源参数的初衷是因为空白内标回收很低的原因，没有基质，那干扰来源于预处理引入的试剂

0

peterhello

第6楼2011/08/04

agilent和waters的离子源可以说是两种不同的设计理念，waters的离子导入转两次弯，离子的绝对量是损失了，但是能更好的排除基质干扰，提高信噪比。Agilent的垂直喷雾能导入更多的离子，但是也可能带入更多的基质干扰。特别对于agilent的离子源来说可能雾化的条件会影响离子浓度在喷雾垂直方向上的分布，从而影响信噪比

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peterhello

第7楼2011/08/04

lz还可以尝试调节一下fragment V相当于waters的cone V

0

yuduoling

第8楼2011/08/04

预处理引入的试剂的干扰有时也挺大，也不可忽略

0

happy爱米粒

第9楼2011/08/04

新窦版主，为什么看不到“回复本帖”了？

0

论坛版主招募|新窦

第10楼2011/08/04

为防止作品被“盗版”论坛做了技术处理，目前就只能用 回复XX楼 这样代替了
xgy2005(xgy2005) 发表:新窦版主，为什么看不到“回复本帖”了？

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