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生物样品预处理方法

xiaowang268

2011/09/09

生物样品预处理方法

生物样品的前处理是体内药物分析的一个重要环节,也是整个分离分析过程中最繁琐的一个步骤。与原料药物和制剂相比,生物样品更为复杂:微量药物分布在大量生物介质中,对分析仪器的灵敏度提出了更高的要求;样品中含有大量内源性物质,不仅能与药物及其代谢物结合,而且常干扰测定。因此,生物样品中的药物必须经过分离、纯化与浓集,必要时还需对待测组分进行化学改性处理,从而为最后测定创造良好的条件。传统的样品前处理方法仍为溶剂萃取法,方法耗时、危害人体、污染环境,萃取使用大量溶剂,分析时需浓缩,会导致有效组分的损失。本文仅对近年相关文献报道的几种药物分析过程中生物样品预处理技术及应用进行综述。

一、超临界流体萃取技术

超临界流体萃取( supercritical fluid extraction ,SFE) 是环保型分离浓集技术,具有萃取效率和选择性高、省时、萃取溶剂(如CO₂ ) 便于挥发、提取物较为“干净”、环境污染少、操作条件易于改变等特点,不仅广泛应用于食品、化妆品、环境、医药及一些天然产物的分析,在生物体内药物分析方面也显示出一定的优势^[1]。

超临界流体萃取技术的原理是控制超临界流体在高于临界温度和临界压力的条件下,从目标物中萃取成分,当恢复到常压和常温时,溶解在超临界流体中的成分立即与气态的超临界流体分开。该技术对于挥发性成分、脂溶性成分、小分子萜类及热敏物质等的提取,较传统方法有很多优越性。

常用萃取剂为CO₂。由于超临界流体CO₂是非极性溶剂,对于低极性和非极性的化合物表现出优异的溶解性能,而对于大多数无机盐、极性较强的物质几乎不溶。通过添加改性剂,如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和水等,并通过加压改善其溶解性能,使超临界流体萃取技术对生物碱类、黄酮类、皂甙类等的应用也日趋普遍。

针对生物样品中通常含有不同极性组分或含有大量脂溶性成分干扰的特点,当前研究工作主要集中在如何提高超临界流体的萃取能力及消除脂类干扰两个方面^[2]。

二、固相萃取技术

固相萃取技术自上世纪70年代诞生以来,以其高效、高选择性、高度自动化的特点,被广泛应用于各种生物样品的分离和纯化^[2]。固相萃取技术以选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱分离原理,对样品进行分离和纯化。

按照所采用固相萃取剂的种类,可将固相萃取法分为3类:正相、反相和离子交换固相萃取。当前固相萃取剂的开发主要侧重于扩大萃取剂的适用范围,将极性、非极性基团,离子交换基团或高分子树脂混合使用的混合型吸附剂,成为目前研究的热点。

根据分析物的极性、溶解度、pKa等理化性质,选取适合的固相萃取柱。对于非离子性物质而言,优先使用极性相似的固相萃取柱,如弱极性或非极性化合物选用C₁₈、C₈、C₂等非极性柱,极性较强的则使用CN、NH₂柱。强离子型分析物则采用离子交换固相萃取。对于某些弱酸或弱碱性化合物,通过调节缓冲液的pH,采用C₁₈等非离子型键和相也可获得理想的萃取效果。

固相萃取一般有4个步骤:活化、上样淋洗和洗脱。新一代的聚合物吸附剂,如Waters的Oasis HLB,不需活化,也不怕溶剂流干,简化了样品制备过程,而且有很宽的pH范围,能萃取亲水、疏水、酸性、碱性或中性组分,特别适用于血浆、尿液等生物样品的制备^[2]。

三、固相微萃取技术

固相微萃取技术(SPME)是一种相对较新型的样品前处理技术,是1990年由加拿大Waterloo大学Pawliszyn研究小组首创。美国Supelco公司于1993年推出了商品化的SPME装置,在分析化学领域引起了极大的反响,已广泛用于环境方面的分析。

近年来,很多的研究用于药物分析,与色谱装置联用,尤其是气相色谱-质谱、液相色谱-质谱的联用。与气相色谱-质谱联用,适用于分析强挥发性或中等挥发性的中低极性化合物;与液相色谱-质谱联用,适用于分析低挥发性或不挥发性的高极性化合物。该技术是基于气-固吸附和液-固吸附平衡的原理^[3],利用待测物对活性固体表面有一定的吸附亲和力而达到分离富集的目的。该技术是由固相萃取技术发展而来:在一根熔融的石英纤维表面涂渍各种不同的色谱固定相或吸附材料构成萃取头,选择性的富集样品中的痕量有机化合物。

目前使用的涂层有聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酸酯,还有一些混合涂料,如聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯、聚乙二醇-二乙烯基苯等。聚二甲基硅氧烷是一种非极性涂层,聚丙烯酸酯是一种极性涂层。该技术具有简单、高效、灵敏度和精密度高的特点,集制备、分离于一体,将以往传统的取样、萃取、浓缩及进样多部分析操作简化为一个简单过程,尤其在操作过程中不需要使用溶剂是其最大的优点。既降低了消耗又避免了污染环境。^[4]

四、分子印迹技术

分子印迹聚合物具有选择性高、稳定性好及制备简单的特点,可用于生物、医药、环境样品等复杂基体中痕量分析物的高选择性分离与富集,因此在样品前处理中的应用特别引人关注。

分子印迹技术是将要分离的目标分子与功能单体通过共价或非共价作用进行预组装,与交联剂共聚制备得到聚合物。除去目标分子后,聚合物中形成与目标分子空间互补并具有预定的多重作用位点的“空穴”,对目标分子的空间结构具有“记忆”效应,能够高选择性识别复杂样品中的印迹分子。

分子印迹聚合物(molecularly imp rinted polymer, MIP)制备简单,能够反复使用,机械强度较高,稳定性好。因此它非常适合用作SPE的填充剂或SPME的涂层材料来分离富集复杂样品中的分析物,以达到分离净化和富集的目的。

MIP作为膜分离的材料可将膜的筛分作用与MIP的高选择性结合在一起,用于样品的富集、回收或去除杂质等。MIP是以某种化合物分子为模板合成的聚合物,对模板分子具有较高的特异性识别能力,类似于酶-底物的“钥匙-锁”相互作用原理。目前,根据印迹分子与功能单体在聚合过程中相互作用的机理,将分子印迹技术分为共价法与非共价法两种类型。

目前各类文献上报道的MIP制备方法基本上是非共价法。在此方法中,印迹分子与功能单体之间通过分子间的非共价作用预先自组装排列,以非共价键形成多重作用位点,这种分子间的相互作用通过交联聚合后保留下来。常用的非共价作用有:氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力等,其中以氢键应用最为广泛^[5]。

五、微波消解法

微波消解法近年来产生的一种崭新的生物样品处理技术，它结合了高压消解和微波快速加热两方面的性能。测定生物样品中的痕量元素时，样品溶液的制备是一个重要课题。微波溶样技术是近年来发展的一种新的极有前途的溶样技术。^[6]

该法的优点是：

1.微波加热是“内加热”，具有加热速度快、加热均匀、无温度梯度、无滞后效应等特点。

2.消解样品的能力强，特别是一些难溶样品和生物试样，传统的消解方式需要数小时甚至数天，而微波消解只需要几分钟至十几分钟。

3.溶剂用量少，用密封容器微波溶样时，溶剂没有蒸发损失，一般只需溶剂5-10ml。

4.减少了劳动强度，改善了操作环境，避免了有害气体排放对环境造成的污染。

5.由于样品采用密闭消解，有效地减少了易挥发元素的损失。

由于生物样品种类繁多，基质不一样，所以对于不同的样品应采用不同的预处理方法，一般可分以下3种：

1.对于反应剧烈的样品，将准备好的样品放在水浴锅或电子控温加热板上加热，并不断摇动溶样杯，让大量的气体释放出，等少量或浅色气体冒出时取下后进行微波消解。

2.对于在常温下需要长时间反应的样品，可将准备好的样品放置过夜，第2天再放进消解炉消解。

3.对于预处理时间长的难处理样品，也可采用放过夜的方法，第2天再进行消解处理。样品经过处理后，若溶液体积小于5ml时，则必须补加水或酸，使其体积不小于5ml，然后再进行微波消解。

总之,生物样品的预处理因其多样、复杂而成为整个检测过程中的关键环节。所述各种处理方法各有其特点,根据化合物的物理化学性质选择合适的前处理方法是取得满意检测结果的必要条件。

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liufeilzu

第1楼2011/09/19

真正实用的是1离心。2有机沉淀和萃取。3固相萃取

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