引物合成常见问题解析

省部重点实验室

2011/09/09

私聊

PCR

Q1.引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

(1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH；

(2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反应；

(3) 封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；

(4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。

Q2.引物合成后如何处理？

切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3'羟基。

纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。

储存：分装抽干。

Q3.需要什么级别的引物？

根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。

应用	引物长度要求	纯度级别要求
一般PCR扩增	< 60base	HEPD
一般PCR扩增	>60 base	PAGE
诊断PCR扩增	< 40base	HEPD, PAGE
DNA测序	20base左右	HEPD
亚克隆，点突变等	根据实验要求定	HEPD, PAGE，HPLC
基因构建（全基因合成）	根据实验要求定	HEPDPAGE
反义核酸	根据实验要求定	HEPDPAGE
修饰引物	根据实验要求定	PAGE, HPLC

Q4.引物的质量是不是跟序列有关？

四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。尤其对于后者，国内公司一般都做不了20个G以上的引物。实验证明，如果引物中有超过三个连续G的结构，传统方法得到的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和PAGE方法都无效。

鼎国昌盛生物公司拥有的HEPD专利技术能够克服高GC或者高G含量引物的合成和纯化障碍，对普通引物、高GC引物和无论长短的oligo d（G）都能得到同样的非常好的结果。

Q5.需要合成多少OD数？

根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。

Q6.如何计算引物的浓度？

引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：

V (微升)= OD数x 33 x 10000 /引物的分子量

引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。

Q7.如何计算引物的Tm值？

引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。

长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) - 600/size＊

＊公式中，Size =引物长度。

Q8.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？

非修饰的引物的分子量（MW）在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)＋(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns-62.

NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。

常规碱基分子量

Base	Molecular Weight
A	313.21
C	289.18
G	329.21
T	304.19
I	314.2
U	290.17

常规修饰基团分子量

5’-Biotin	405.45	3’-TAMARA	623.60
5’-(6 FAM)	537.46	3’-Dabsyl	498.49
5’-HEX	744.13	3’-(6 FAM)	569.46
5’-TET	675.24	3’-Amino Modifier C3	153.07
5’-Cy5	533.63	3’-Amino Modifier C7	209.18
5’-Cy3	507.59	3’-Thiol Modifier C3	154.12

Q9.如何溶解引物？

干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好瞬时离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或TE(pH8.0)缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。

Q10.如何保存引物？

引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。

干粉：运输时常温运输，-20℃可以保存一年。

储存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，-20℃可以保存半年。

工作液：常规使用，4℃保存，也可-20℃保存，但应避免反复冻融。

修饰荧光引物：需要避光保存，尽快使用为宜。

Q11.最长可以合成多长的引物？

我们合成过100base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80base。引物越长，出现问题的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base的粗产品，全长引物的百分比不高，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。

Q12.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?

主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格也高。

Q13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？

连接反应需要引物的5'磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。

Q14.为什么引物的OD260/OD280小于1.5？

需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。下表是一个20base同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。

A_260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
Base Composition	A_260/280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3	2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3	1.85
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3	1.15
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3	1.14
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3	1.66

Q15.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？

通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。

Q16.如何检测引物的纯度？

实验室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。

Q17.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

如果您溶解引物的水pH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。