一波三折的样品方法调试过程（9月）

因为当时有个乙腈/水=60/40的流动相就先进一针试试吧，主峰在7min左右，原料在14min'左右出来，另一个原料在3min左右，考虑到不知是否还有其他杂质，于是选用了一个梯度的检测方法，色谱柱选用的是月旭的AQ-C18色谱柱，流动相为乙腈/水（0.1%三氟乙酸）=60/40，为什么用三氟乙酸呢？刚才已经说了是临时借用的其他产品的流动相调试的，所以就没有做改动了。

分析条件：

色谱柱：上海月旭公司的AQ-C18色谱柱；250mm*4.6mm，5um

梯度方法：流动相：A/B=ACN/0.1%三氟乙酸 梯度

0 60 40

13 95 5

22 60 40

这是分析的谱图。图片1



从谱图上看，组分的异构体没有显现出来，当时的样品是主产品：异构体=1:1，谱图中仅显示一个组分，并且将主产品和异构体分别进样分析，保留时间是基本一致，由此基本可以确定异构体没有分离出来。

之后调整流动相的各种比例，效果不是很理想。后来将流动相的缓冲盐更换为磷酸二氢钾，见下图，效果还是不行。

因为手边色谱柱不是很多，再说自己单方面摸索时间也耗得比较久，于是就寻求色谱柱厂家的帮助，国产色谱柱厂家与月旭公司比较熟悉，就咨询月旭公司的应用工程师，将相关资料与工程师沟通后，月旭工程师推荐了一款苯基柱，PFP-C18，250mm*4.6，5um色谱柱。当时就申请试用，第三天就收到了这款色谱柱，方法基本没有都大的变化。

分析条件：

色谱柱：上海月旭公司的PFP-C18色谱柱；250mm*4.6mm，5um

梯度方法：流动相：A/B=ACN/0.1%磷酸二氢钾 恒流（见图2）



从这张谱图看，异构体能明显分离出来，但分离效果不是很理想，并且保留时间接近20min了，如果要达到足够的分离，必须增加水的比例，但这样造成的后果是保留时间更长，分析时间太长对于生产控制来说绝对不是一个很好的分析方法，所以最终放弃了。

再次与月旭工程师联系后，工程师推荐了另一款LP-C18色谱柱，250mm*4.6mm，5um于是继续申请试用。

在接到试用的色谱柱后，按照原有的方法进行了摸索。这是分析的谱图，（图3）样品按照1:1的比例，基本达到了基线分离，再说实际生产的样品，异构体的比例不可能有这么多，正常的反应粗品异构体含量一般在5%以下，因此完全可以达到控制要求，分析时间相对来说也不是很长，于是基本决定选用这根色谱柱了。

最后所要做得就是在此基础上对方法进行进一步优化，这是优化后的样品分析谱图。（图4）当然这个方法可能不是最好的，但目前来说是个比较适合的方法。13.28min的组份就是我们所需用监控的异构体。




通过这次一波三折的方法调试，告诉我们：对一个产品的方法开发，首先需要查找相关资料，如果有现成的分析方法，我们会减少很多的调试时间；如果查找不到只能依靠自己的摸索，对于HPLC来说，关键在于确定检测波长，组分的分离度主要靠色谱柱的选择，这就相对比较简单了；在摸索过程中一定不要忘记寻求专家的帮助，特别是色谱柱生产厂家的工程师帮助，对于一个工厂来说，选择色谱柱的空间相对来说比较狭小，但对于生产厂家来说，选择的范围就扩展了很多，同时这些工程师的分析经验也是比较丰富，能帮助你减少很多的弯路。

这对于我们开发分析方法很有借鉴意义

我们一个手性化合物自己一直搞不定，后来交给大赛路很快就有结果了。

因为生产厂家大多有产品库，结构相似的，分析方法也比较接近。

淮北的工作站是N2010吗？

不是N2010，是福立的工作站

手性样品的分离能够做到这样，不错了。