随着我国的制药企业不断地发展，高效液相色谱法越来越多地用于药物的含量测定、有关物质的控制及稳定性考察等方面。色谱柱是其中很重要的一部分，十八烷基硅烷化键合柱（又称C18柱）就占90％的比例。在长期的液相色谱分析工作中，发现色谱柱使用一段时间后，随着使用时间的推移、进样次数的增加，色谱柱往往会出现柱效降低，色谱峰峰高降低、峰宽加大、分离效果不佳、峰形不流畅的情况，也会有裂峰、肩峰、拖尾峰等情况出现，给日常的分析工作带来一定的困难，严重时直接可以使分析工作停顿下来。而且，挑选质地较好的液相色谱柱，价格约为3000～5000元不等，弃之不用报废实在可惜。为此，我们需要探索出解决此类问题的方法，满足检验要求，降低成本，达到为实验室降损增效的效果。
分析原因
一般情况下，C18柱（或C8柱，下同）在遇到极酸极碱的溶剂等情况下，会使填料的碳链发生断裂或倒伏情况，此种情况色谱柱不能再生。但最多的情况有以下几种情况：
1 色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；
2 色谱柱头的填料被样品或流动相污染，使样品进样后到色谱柱头上不能形成层析展开；
3 色谱柱的C18的材质吸附中心表面受到污染掩盖，影响吸附脱附作用。
对策实施
我们对色谱峰峰高降低、峰宽加大或出现肩峰的色谱柱进行再生修复。具体步骤如下：
1 卸下色谱柱头，将筛板放在色谱甲醇中超声5min。
2 修补柱头。挖掉一点柱头被污染的部分，用C18干粉的填料补充。
3 采用不同溶剂依次以15倍色谱柱的体积的甲醇、超纯水、异丙醇、乙腈冲洗。
确认效果
挑选实验室内有修复再生可能的部分色谱柱经再生修复后，重新使用于样品测定。通过比较再生前后HPLC图谱，确认色谱柱再生后的实际效果。
1、头孢哌酮钠含量测定色谱柱
样品：头孢哌酮钠
色谱柱来源：月旭材料科技（上海）有限公司
色谱柱材质：十八烷基硅烷键合硅胶柱（C18），5µm，4.6×250mm
流动相：三乙胺醋酸溶液(三乙胺14ml与冰醋酸5.7ml，加水稀释至100ml，摇匀)-乙腈-水（1.2：180：820），并用冰醋酸调节pH值至3.0±0.2。
检测波长：254nm
进样量：20µl
流速：1.2ml/min
系统适用性溶液：含头孢头孢哌酮、头孢哌酮杂质A和头孢哌酮S异构体各0.2mg/ml的混合溶液。
色谱柱问题描述：
该柱使用两年半后，在头孢哌酮钠系统适用性图谱中，头孢哌酮峰分离不流畅，出现裂峰、肩峰，峰已成M形，见图01图02，此色谱柱已不能用于样品分析。
图01 再生前头孢哌酮系统适用性HPLC图谱（叉峰）
图02 再生前头孢哌酮系统适用性HPLC图谱（肩峰）
色谱柱再生后：
经再生修复后，裂峰肩峰消失，头孢哌酮峰形明显好转（本已废弃的柱子又恢复了生机）。按头孢哌酮杂质A、头孢哌酮和头孢哌酮S异构体的顺序出峰，各峰间的分离度3.43、2.56，均大于1.5，且头孢哌酮主峰理论塔板数达9291，符合测定要求，见图03：
图03 再生后头孢哌酮系统适用性HPLC图谱（峰型完美）
2、氯沙坦钾氢氯噻嗪片含量测定色谱柱
样品：氯沙坦钾氢氯噻嗪片
色谱柱来源：奥泰公司HP改良产品
色谱柱材质：辛烷基硅烷键合硅胶柱（C8），5µm，4.6×250mm
流动相A：0.01mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾2.5g及磷酸氢二钠3.0g，加水溶解并稀释成2000ml，用三乙胺调节pH值至7.0）-乙腈（85：15）
流动相B：乙腈
检测波长：225nm
进样量：10µl
流速：1.0ml/min
对照品溶液：含氯沙坦钾和氢氯噻嗪分别为0.12mg/ml、0.1mg/ml的混合溶液。
梯度洗脱比例：
时间（min） | 流动相A% | 流动相B% |
0 | 80 | 15 |
10 | 40 | 60 |
11 | 85 | 15 |
15 | 85 | 15 |
色谱柱问题描述：
该色谱柱使用一年半后，在氯沙坦钾氢氯噻嗪片对照品色谱图中，氢氯噻嗪峰峰高降低、峰宽加大，且有肩峰出现，见图04。
图04 再生前氯沙坦钾氢氯噻嗪系统适用性HPLC图谱
色谱柱再生后：
经再生修复后，肩峰消失，氯沙坦钾和氢氯噻嗪峰分离明显，分离度由之前的4.43提高到8.60；理论板数也提高很多，要求按氯沙坦钾峰计不低于2000，实际理论板数达到17773，见图05。
图05 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪系统适用性HPLC图谱
再看对照品色谱图，双对照进样5针，氯沙坦钾和氢氯噻嗪校正因子RSD分别为0.1％、0.5％，见图06～10。图11～12为样品图谱。
图06 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪对照溶液HPLC图谱（一）
图07 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪对照溶液HPLC图谱（二）
图08 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪对照溶液HPLC图谱（三）
图09 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪对照溶液HPLC图谱（四）
图10 再生后氯沙坦钾氢氯噻嗪对照溶液HPLC图谱（五）
下表列出了氯沙坦钾及氢氯噻嗪对照图谱数据：
序 号 | 氯沙坦钾 | 氢氯噻嗪 |
称量mg | 峰面积 | 校正因子 | 称量mg | 峰面积 | 校正因子 |
1 | 24.74 | 4404.51709 | 5.6170E-03 | 30.35 | 1923.80798 | 3.1489E-03 |
2 | 24.74 | 4403.29150 | 5.6185E-03 | 30.35 | 1908.63281 | 3.1739E-03 |
3 | 24.22 | 4322.09375 | 5.6038E-03 | 30.12 | 1918.61426 | 3.1335E-03 |
4 | 24.22 | 4319.61035 | 5.6070E-03 | 30.12 | 1909.71973 | 3.1481E-03 |
5 | 24.22 | 4317.09277 | 5.6103E-03 | 30.12 | 1917.88306 | 3.1347E-03 |
RSD | 0.1％ | 0.5％ |
图11氯沙坦钾氢氯噻嗪片样品100311003批HPLC图谱（一）
图12氯沙坦钾氢氯噻嗪片样品100311003批HPLC图谱（二）
3、头孢哌酮钠舒巴坦钠含量测定色谱柱
样品：头孢哌酮钠舒巴坦钠
色谱柱来源：美国色谱科公司产品
色谱柱材质：十八烷基硅烷键合硅胶柱（C18），5µm，4.6×250mm
流动相：0.005mol/L四丁基氢氧化铵溶液（取40％四丁基氢氧化铵溶液6.6ml，加水800ml后，用1mol/L磷酸溶液调pH值至4.0，再用水稀释至2000ml，摇匀）-乙腈（50：18）。
检测波长：220nm
进样量：10μl
流速：1.2ml/min
系统适用性溶液：
含头孢哌酮和舒巴坦为1mg/ml的混合溶液，其中相对保留时间约为0.9 的为头孢哌酮降解物峰。
色谱柱问题描述：
该柱用于头孢哌酮钠舒巴坦钠样品分析，使用一年多后，在系统适用性图谱中，头孢哌酮降解物峰、舒巴坦峰以及头孢哌酮峰响应值均下降，拖尾严重，见图13。
图13 再生前头孢哌酮钠舒巴坦钠系统适用性HPLC图谱
色谱柱再生后：
经再生修复后，各峰的响应值与之前比较有所好转，拖尾现象得到明显改善，分离度有所提高，理论板数按头孢哌酮降解物峰计也符合测定要求（≥3000），见图14。
图14 再生后头孢哌酮钠舒巴坦钠系统适用性HPLC图谱
经济效益
在对色谱柱再生修复前，一年的费用有41.3万元，进行色谱柱再生后，一年的色谱柱费用降为29.8万元。可从下图中直观了解：
经过再生修复后色谱柱，柱效及分离度都有不同程度的提高，峰高降低、峰宽加大、裂峰、肩峰等问题都得到了解决。再生效果比较好，解决了分析中的问题，延长了色谱柱的使用寿命，节约了分析成本。
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