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让逆流色谱技术为中药现代化服务
shime
2003/11/11
私聊
液相色谱(LC)
摘 要:逆流色谱技术是一种新颖的分离技术。它是不用任何固态支撑体的液液分配层析法,则能够完全
排除支撑体导致的不可逆吸附和对样品的玷染、失活、变性等影响,能实现对复杂混合物中各组分的高纯度制备量分离。本文概述了这一技术的特点、发展简史和应用情况,并就中药成分高纯度标样的制备、新药研究、高质量中间体生产和生产过程的质控等问题,对如何使此项技术为中药现代化服务提出了建议。
关键词:分离纯化科学 分离 纯化 逆流色谱 中药活性成分 分离提纯
逆流色谱技术Countercurrent Chromatography (CCC)是当今国际分离科学技术的一个新颖的分支[1]。它的突出特点是在用很长的软管(如聚四氟乙烯管)绕制成的色谱柱内不加入任何固态支撑体或填料。使用时由使用人根据被分离混合物的理化特征,选择某一种有机/水两相溶剂体系或双水和溶剂体系,此体系可以是二元的或多元的。用此体系的上层或下层作为色谱过程的固定相,首先将其注满管柱内,然后让此管柱作特定的旋转运动,用由此形成的离心力场来支撑住柱内的液态相。这时,若用溶剂体系中的另一层作为流动相,带着混合样品由泵的压力推人分离管柱,样品就会穿过两个
液相
对流的整个管柱空间,各个组分也就会按其在两相中的分配系数(即某-组分在流动相中的溶解度同它在固定相中的溶解度的比值)分离开来。
一、逆流色谱技术的特点
1. 逆流色谱不用固态支撑体,完全排除了支撑体对样品组分的吸附、玷染、变性、失活等不良影响。所以,能避免不可逆吸附所造成的溶质色谱峰拖尾现象,能实现很高的回收率。例如,对于黄酮等易被填料吸附的物质的分离与制备就具有明显的优势。
2. 逆流色谱的分配分离是在旋转运动中完成的,两相溶剂都被剧烈振动的离心力场依其界面特征甩成极微小的颗粒,样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配,并且能在颗粒振荡与对流的环境中有效地传递。所以,它就象是把通常的溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续地予以完成。
3. 没有填料在柱内的占空体积,逆流色谱的分离柱又容易做得容积大些,柱内空间全部是有效空间。所以,它的样品负载能力很强,制备量较大,而且重理性很好。
4. 逆流色谱不用填料,分离过程不是淋洗或洗脱过程,而是对流穿透过程。所以,能节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗,运行使用的后续投入较低。逆流色谱的分离效率比不上
气相色谱
和高效
液相色谱
等技术,不适宜用它去完成组成复杂的混合物的全谱分离分析。而它对于样品预处理条件的放松,以及它的回收率高,制备量大的优点,作为特定部位和特定组分的分离纯化与制备则是十分可取的。
二、逆流色谱技术的发展概况
逆流色谱的基本模型早在20世纪60年代就由Dr.Yoichiro Ito创立[2],经过数10年在美国国家健康研究院(NIH)的实验室研究,特别是在近20年,高速逆流色谱技术(High-Speed CCC,HSCCC)[3]的出现,使它进入了在世界范围内推广应用的阶段。每年一度的美国匹兹堡国际分析化学与应用光谱学学术会议上,都设有CCC的专题组;’Journal of Chromatography’、’Journal of Liquid Chromatography’等重要学术刊物曾多次出版这一技术的论文专辑。近10年间,HSCCC在生物化学、医药学、农业、环境、材料、化工、海洋生物
以及无机离子等众多领域的成功应用,使之成为一种引人注目的技术手段。1996年,在美国由John Wiley&Sons,Inc出版了《High-Speed Countercurrent Chromatography》一书,笔者应邀撰写了该书的HSCCC on Medicinal Herbs一章[4],此书被选编为著名的分析化学丛书第132卷,作为一项新技术向世界传播。2000年9月,逆流色谱技术国际委员会在英国Brunel大学召开了此技术的第一届国际学术会议CCC-2000,笔者参加了会议的组织领导工作并作了天然产物分离纯化方面的特邀报告。受该国际委员会的委托,我们将于2002年4月在北京召开此项新技术的第二届国际学术会议,CCC-2002将突出天然产物研究与开发的主题。
1978年,当时任我国卫生部药品生物制品检定所所长的周海钧教授,世界卫生组织的资料中获知Dr.Ito正在美国NIH研究开发实现逆流色谱的设备,并已用于抗生素异构体的分离。周先生建议笔者研制此种设备以配合我国的抗生素质检工作。1980年,我们研制出了我国第一台逆流色谱仪,并由检定所抗生素室用于抗生素成分的分离与分析检定[5]。在蔡定国教授等植物药学专家的帮助与合作下,完成了首批生物碱、黄酮等类中药成分的分离应用研究,其结果引起了国内外的关注。这些工作,确立了我国在CCC技术及其应用研究方面的国际领
先地位。1987年,笔者应美国NIH邀请,赴美同Dr.Ito合作从事CCC技术及相关生物工程技术的研究,共同推进了HSCCC技术的发展并获得美国发明[6]。在美期间,笔者还同蔡定国教授、中国医学科学院药物所方起程教授、华西医科大学药学院肖悼英教授、肖蓉教授等密切合作,发表了一批甩HSCCC分离制备天然药物活性成分的论文,为形成我国CCC技术在这一应用研究领域的国际领先优势和技术特色打下了基础。近十多年来,我国关于CCC技术的研究开发工作始终同天然产物(如中草药和农产物)的研究开发工作密切地结合着。
三、逆流色谱技术为中药现代化服务的设想
我们经过20余年的科研实践,已经建立了具有自主知识产权的快速分析型HSCCC、半制备型HSCCC、两维制备型HSCCC、pH区带制备型HSCCC和大分子蛋白质分离用的CCC等系列化的技术成果。应用这些技术成果,我们开发出了数10种常用中草药和茶叶等农产品中数百种单体成分的分离纯化与制备的工艺技术。这些成分包括黄酮类、生物碱类、蒽醌类、皂苷类、大环内酯类、多酚类、儿茶素类、多糖类、糖蛋白类等等不同类别的物质。例如对于银杏黄酮苷元、异鼠李素、山柰酚、茶叶中儿茶素EGCE、EGC、GCG、红豆杉中紫杉醇及其类似物、白藜芦醇和白藜芦醇昔、番茄红素等等,都已建立了制备纯度达到98%以上的工艺技术。
不论是从中医药的理论基础和思维体系,还是从中药的功能主治和临床效果来看,中药都不会象西药那样采用单纯的成分人药。我们利用先进的技术,制备药物中活性部位和活性成分的主要目的是一种技术表达,绝不是企图违背中药的辨证与协同的根本法则。恰恰相反,我们希望利用这一手段,从标准物质、检定方法、活性研究、功效阐述、生产和产品的质量控制等方面,去演绎中医药的精髓,丰富国际交流和促进理解的技术语言,推动传统中药的科学化和现代化。
我国正在中药行业推广CO2超临界萃取、大孔树脂层析和膜分离等技术。逆流色谱技术同前三者比较,其制备规模较小,但是选择性和分离、分辨能力较强。因此,逆流色谱可以作为前三者的后续步骤,用以完成进一步的分离纯化。美国NIH曾经支持过这样一个技术方法学的研究课题,即是针对象紫杉醇等价值较高的物质的分离制备,采用CO2超临界萃取做前期提取,高速逆流色谱做分离纯化,高效
液相色谱
做最终的分离分析与鉴定。以这样的技术架构,来表达一种天然纯净的、高回收率低消耗的、高效率的技术制程。
我们是研究工程技术的,对于中医药而言是外行。通过我们的工作与学习,对于如何让CCC技术为中药现代化服务的问题,初步形成了以下几点设想:
1. 配合中药质量栓定,制备高纯度的药用成分标准品或参照物。
2. 在高类别中药新药的研发中,逐级分离制备活性部位或活性成分,配合活性跟踪与入药部位的设计。
3. 配合高类别中药新药申报工作,制备必需的高纯度指标成分和必需控制的杂质成分。
4. 配合中药材和中药方剂指纹谱的建立,对其中某些组分或组分群进行分离制备,以提供更丰富和准确的信息和数据。
5. 针对有较高纯度等级要求的药用原料的生产需要,扩大制备规模,建立逆流色谱中试生产技术体系。
6. 配合中药生产中原料-加工-成品的质量控制工作,探索快速倘使的质控新方法。
7. 积累和建立中药活性部位或活性成分的分离纯化工艺技术数据库,为新一代的中药新药研发提供物质的和技术的支持。
以上设想希望得到各界的批评指教。
结 语
逆流色谱技术本身还在发展,还有不少问题有待研究和改进。从国际范围来看,也还未见将此项技术直接引用于某一特定的产业。但是,近年来的应用结果和发展趋势表明,这一新兴技术将会在天然产物的相关产业中展现良好的应用前景[7]。我国中医药的渊源与优势、我国中药的丰富资源以及中药中物质组合的特征,似应成为关注和吸引逆流色谱技术的基础。如果我们能花一些力气,在国际上率先将这一新技术的研究与应用同中药现代化的宏伟事业结合起来,对于科学技术的进步、对于中药科研和产业的发展,似是有所裨益的。
参考文献
1. 张大佑.《逆流色潜技术》.北京科学技术出版杜. 1991.
2. Y.Ito,R.L. Bowman,’Countercurrent Chromatography’,Science. 1970.
3. Y.Ito,’High-speed Countercurrent Chromatography’,CRC Crit.Rev.
Anal.Chem.1986.17:65.
4. T.Y.Zhang,C
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