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老生常谈，样品前处理相关知识；有问必答！

xiongbb

2011/12/11

私聊

前处理综合讨论

不是标题党，确实会连载的！有时间就来写点，写错了的地方就提出来，我好修改，互相学习，有木有

一个样品分析过程，包括样品的采集、前处理（spe、lle==）、分析、数据处理以及整理报告存档。整个分析过程样品前处理最花时间、最繁琐，也是最容易出错的地方。曾经幻想过一种仪器，把奶粉倒入仪器，就可以分析出来三聚氰胺、维生素、蛋白质、脂肪酸==参数。既然实现不成，来概述一下样品前处理的理想条件：

1、选择性的将一个或者一类目标物从基质中分离出来；（例如蔬菜中农药残留测定，蔬菜就是基质）
2、分离出来的目标物，应该保持原来的基本特征，不能产生变形或被破坏；（例如降解、分解、代谢）
3、速度快，满足快速响应以及高通量样品分析的需求；
4、方法简单，普适性好；
5、成本低；
6、最重要的一点，重现性、回收率要好！

总结一下样品前处理的目的：

1、从样品基质中提取目标物，将目标物从样品基质中分离出来；
2、将样品中所含有的对分析仪器有伤害或对目标物分析有干扰的成分去掉；
3、为样品分析提供一个合适的条件--调节样品酸碱度、调节样品固体、液体、气体等状态==；
4、富集样品中基质微量有害物质；

样品前处理种类？

1、液液萃取
2、固相萃取
3、固液萃取
4、蛋白沉淀
5、固相微萃取
6、超临界萃取
......

种类很多了，以固相萃取为主讲；固相萃取概述、原理、填料、规格、仪器、方法建立、应用、固相萃取柱对比；哈哈。慢慢连载了。先去超市买粮食，回来使劲写呀，吼吼
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回来了，继续写点；上回写到固相萃取；先了解一下固相萃取的定义：固相萃取是基于色谱分离的样品前处理方法。固相萃取包括固相（具有一定官能团的固体吸附剂）和液相（样品及溶剂）。由于固相萃取吸附剂具有不同的官能团，能将特定的化合物吸附并保留在固相萃取柱上。根据使用的目的我们可以将固相萃取划分为两种模式。一种是经典的固相萃取模式，spe柱主要是用于吸附目标物，叫做目标物吸附式化合物；另一种是杂质吸附式固相萃取，指的是spe柱吸附样品种的杂质。具体后面在讲操作的时候会给大家在介绍。

来点百度到的东西:固相萃取发展史，此处略去2w字，固相萃取技术已经成为许多实验室必不可少的前处理手段，全世界实验室每年消耗数以吨计的固相萃取材料。

话说固相萃取柱，主要是由柱管、填料、筛板组成。据不完全统计世界上有50多个厂家生产固相萃取柱，其中以waters、agela、瓦里安、supelco等几个尤为著名，其它厂家还有很多类似迪马、奥秘、热电、岛津==；

柱管：聚丙烯、玻璃
填料：这个种类就多了，反相柱、正相柱、离子交换柱==

固相萃取的作用：
1、分离富集：将目标物从大量的样品基质中分离出来，并除去样品基质，同时将样品转化为仪器能够接受的形式之后才能进行仪器分析。固相萃取既适合用于小体积样品中的目标化合物分离及基质去除，也适用于对大体积样品中的微量目标化合物富集。
2、净化：样品前处理主要目的之一就是要除去样品中对仪器或分析有干扰的成分或杂质。
3、转换溶剂：固相萃取中没有乳化的问题，没有发生有机溶剂和水相的直接作用。

固相萃取的局限性：

1、样品必须呈液态或者气态；

固相萃取的基本原理：

经过spe柱预处理、样品过柱、spe柱淋洗/干燥、目标物洗脱等几个步骤就可以完成，但是，掌握好这项技术，并不简单，其中固相萃取的原理比较复杂，影响因素也很多。目标物和spe填料作用力主要为非极性力、极性力、离子作用力、共价作用力及多种作用力。影响因素也很多，例如ph、样品基质、洗脱流速等等。下面一一介绍。

休息咯~~明天再写，介绍固相萃取中各种作用力以及影响因素。
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我又来开始咯，不过只能写一点，下午要去成都。

关于固相萃取填料和目标物之间作用力我也没搞特别明白，说的不对的地方尽量提出来。

1、非极性力

非极性作用力产生于固相萃取材料官能团上的碳氢键与目标物的碳氢键之间。这种作用力是范德华力货散射力。一般在固相萃取中几种常见的作用力，非极性作用力最小，经常用于从样品基质中吸附分离具有非极性结构的目标物。常见的非极性键合相有c18 、c8、苯基。通过非极性作用力吸附在非极性Spe柱上的目标物，可以具有非极性性质的溶剂洗脱，如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯，只要溶剂的洗脱强度足以破坏目标物与spe填料之间的范德华力，就可以把目标物从spe柱上洗脱下来，即便是极性较强的甲醇，对于许多化合物来说也具有足够的非极性作用力将其洗脱。如如果洗脱溶剂不能把疏水强的目标物洗脱下来，可以考虑二氯甲烷：乙酸乙酯=1:1

2、极性作用力

极性作用力发生在spe柱极性官能团和目标的极性官能团，包括氰基、羧基、氨基、羟基、等等。。。。作用力主要是氢键，ππ键等。极性作用力的强度比非极性作用力大，比离子作用力小。常见的固相萃取材料有：硅胶氧化铝佛罗里硅土、氨基、二醇基等。
非极性的基质环境有利于吸附剂和目标化合物之间的极性作用力，因为非极性溶剂没有能够和spe填料极性官能团形成极性作用力。
常用的洗脱溶剂有：水甲醇乙酸乙腈丙酮乙酸乙酯。

3、离子作用力

离子作用力发生在带相反电荷的目标物与固相萃取填料之间，在离子交换固相萃取中，样品基质可以是极性，也可以是非极性，但是离子交换的选择性是3中作用力中最好的。

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不好意思好久没写了，一直在成都出差，我都忘记调理了，关于非极性、极性、离子作用力在简单说一下，如果大家有兴趣在继续跟帖提问吧，我会尽可能挑我会的回答大家哈哈

简单聊一下关于离子作用力方面的知识；对于化合物而言，至少具备“可生成”阳离子（阴离子）的官能团，这里用可生成就是说化合物在一定条件下带电荷，例如ph的影响。有些时候，一些容易电离的样品，在c18柱上保留不够强，但是在一定ph值下，会抑制电离显中性，可以增加在c18上的保留。我在这里提到的是说ph使有机物呈离子状态，才可以选择离子交换柱。常见的阳离子官能团有，伯仲叔丁胺类，常见的阴离子包括羟基磺酸基磷酸基等。

使用离子交换机理将目标物吸附在spe柱上，必须满足2个条件：

1、样品基质或者上样环境的ph必须使目标物和spe柱带相反的电荷；
2、环境不能含有高浓度的和目标物竞争的物质；

首先带大家认识一下pka，这个东西是做spe方法的时候，对于调节基质和环境ph至关重要。pka就是化合物50%呈离子状态，50%呈中性状态时的ph。对于弱酸性而言，HA ---H+ + A - ； [A-]/[HA]=10 ph-pka （这个地方不知道怎么编辑，就是10的ph-pka 次方），当[A-]/[HA]=100时，99%弱酸性化合物成离子状态，可以被阴离子吸附剂吸附。所以在进行阴离子固相萃取吸附时，要是弱酸性化合物99%离子化，样品基质的ph应该高于2个单位的pka，反之，在弱酸性化合物进行洗脱时候，应该将环境的ph少于2个单位的pka，此时弱酸性化合物呈中性，用适当溶剂就可以将其洗脱。

不知道大家有没有看明白，嘿嘿，下面我带大家认识一下固相萃取中的一些名词（百度也可以找到）：

1、柱床体积：对于成品spe柱中spe的吸附剂，所需充满吸附剂颗粒以及内孔的溶剂体积=柱床体积。对于现在大部分成品柱 40微米、60A的吸附剂，柱床体积大约为120μL/100mg吸附剂；

2、柱穿透：目标物在上样的过程中，样品没有被spe填料吸附而保留，当目标物在吸附剂的保留太弱或者样品超过填料吸附容量时就会发生穿透，（当年我学spe的时候，最开始做的就是最大上样量，心酸呀，很怀念。）

3、柱容量：在一定得溶剂环境下，给spe填料能够保留目标化合物的总量，有的时候对干扰物也保留，应该算在内哦。柱容量影响因素蛮多的，和基质和柱预处理好坏都有关系，通常，柱容量不会大于吸附剂质量的5%；

4、柱体积：常见的spe柱有1、2、6ml，此处指空spe柱的体积，柱体积不等于可以加载spe柱的样品体积。spe柱的载样量取决于柱容量和样品浓度，通常载样量大于柱体积。其中现在很多厂家也推出了大规格萃取柱，60-150ml不等。

5、预处理：就是活化，主要目的是使spe柱达到萃取的最佳状态和达到一定的上样条件。

6、干燥：在对目标物洗脱之前，对spe柱进行干燥的目的是去除萃取柱中水分，以便更好地洗脱，防止对后面分析仪器的损害。

7、洗脱：洗脱是适当溶剂将目标物从spe柱上洗脱下来。

8、封尾：降低硅羟基数量。

9、表面积：填料的表面积指填料颗粒外表面以及微孔表面的总和，单位为平方米/g.

10、通量：每天处理的样品数。

11、基质：样品基质指目标物所处的样品环境。

今天写到这里，明天写操作了。嘎嘎。

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我来啦，哈哈，继续来更新，今天来讲点好的，固相萃取操作！

不废话，先上图：

目标物吸附模式：

杂质吸附模式：（图百度的，样品加工感觉错了，是样品加入）

以目标物吸附为例介绍固相萃取操作：

（1）固相萃取柱预处理（活化），固相萃取柱预处理对固相萃取来说至关重要，无论是自己填装还是成品spe柱大部分是以干燥的状态存在，以c18为例，入下图，干燥状态的C18链是杂乱无章的覆盖在键合硅胶表面。如果这个时候以水为基质的样品载入c18，填料颗粒表面上右击键合c链会被水分子包围，水分子极性较强，和c链相斥，水的表面张力以及粘度使得样品无法进入干燥状态的c18微孔，减少目标物的保留。

值得注意的是，当固相萃取柱被完全预处理，样品是需要以水为主的体系，所使用的活化剂不但能使得固相萃取填料c18链最大程度展开，还必须是水溶性的有机溶剂。c18柱很好的活化剂有甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等等。

固相萃取柱预处理目的：

1、对spe柱进行活化，激活活性基团（上面说的c18链为活性基团），对spe柱进行清洗，去除spe柱上吸附的对分析有影响的杂质；
2、对spe柱进行平衡，给样品提供一个良好的环境；

反相spe柱一般预处理程序为：
1、用甲醇或极性有机溶剂过柱子；
2、用水或缓冲盐过柱子；（目的是去除柱子有机溶剂，因为甲醇这些是良好的洗脱溶剂；为上样提供良好的环境；）如果是离子交换柱，必须保证目标物呈离子状态。

值得注意的是：对于已经预处理好的spe柱载入样品前必须保持湿润，这点对于键合硅胶柱和非亲水性高聚物尤为重要，否则会出现回收率低、重现性差的问题。如果载样之前发现spe柱流干状态，应该重新进行平衡。

(2) 样品过柱：样品过柱的主要目的是要将目标物定量的保存在spe柱上，使其与未保留的样品基质及干扰物分离。样品过柱的流速必须控制，（后面我会提到流速对固相萃取的影响），流速慢有利于对目标化合物的吸附，但是流速过慢会增加整个固相萃取时间，另外流速过慢还会增加杂质被吸附的机会，对目标化合物的检测分析不利。流速大小还和spe柱填料有关，包括粒径、孔径、基质、面积等；

干活去了，后面写洗涤，干燥，洗脱。
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俺又来了，嘎嘎。

（3）洗涤： 减少杂质对目标物的干扰，延长分析仪器的寿命。在不影响目标物的情况下去除干扰物。
（4）干燥：一般是为了洗脱创造一个好的条件，和减低对分析仪器的影响。
（5）洗脱：目标化合物的洗脱在整个固相萃取过程至关重要，为了完全洗脱目标物，必须选择合适的洗脱溶剂。

1、洗脱剂对目标化合物必须有足够的洗脱强度，以便以最小的体积将目标物洗脱下来。
2、洗脱剂必须有足够的选择性，立项的洗脱溶液应该能够选择性的洗脱目标物，而将保留能力强的干扰物留在spe柱上。
3、洗脱溶剂尽量与分析仪器相匹配。

洗脱溶剂的流速对洗脱的效果也有很大影响，后面会描述，持续关注呀。

PH对固相萃取的影响;

开始接触spe时，一直认为ph只对离子交换型的固相萃取模式有影响，实际上，对其它填料的固相萃取，也有很大影响。
以c18为例，当化合物呈离子状态时，c18对于目标物的保留会大大降低，因此，对于弱酸性化合物，也要注意控制ph。例如呈离子状态的酸性除草剂在c18很少保留，而在萃取前对样品溶液进行酸化，抑制样品离子化，可以大大提高回收率。

首先，在根据萃取机理选择固相萃取柱类型的时候，必须要考虑目标物和杂质的不同ph条件下的状态，假设目标物呈阳离子状态，而干扰物也是阳离子状态，这个时候采用阳离子交换柱对目标物进行萃取，最后的洗脱组分中可能含有大量干扰物。为了避免干扰，可以考虑调解基质ph，使样品呈中性，采用非极性柱萃取。
还有另一个因素需要注意，在spe柱中以硅胶为基质的封尾率在70%，还有一部分si-oh，在ph大于2的时候，这些si-oh都是带负电的，当采用非极性柱对可生成阳离子的弱碱性化合物进行萃取时，必须注意控制样品的ph。

对于离子色谱而言，就不多介绍了，比较简单，就是注意pka和ph之前的关系就好了。

样品基质对固相萃取的影响：

由于我们要分析的目标物都是存在样品基质中，所以必须考虑样品基质对目标物的影响，例如奶粉中分析三聚氰胺，需要去除蛋白之类的干扰，等等。
样品基质中的其他成分目标化合物之前相互作用，可能造成目标物无法被spe柱保留，导致回收率下降。因此在固相萃取中，基质性质的重要性不亚于目标化合物本身。
样品基质的ph、极性特征、离子强度等都能阻碍spe柱对目标物的萃取。还有一些需要考虑目标物与蛋白质的结合，使其失去能够与固相萃取吸附官能团的有效官能团，因而无法被spe柱保留。还有蛋白质是大分子，无法进入填料颗粒的微孔与官能团发生作用，而无法保留。

固相萃取方法建立与优化（比较简单，我自己的理解）：

1、收集样品信息。

目标物名称、cas号、目标物结构（或者主要官能团）、pka、在水中溶解度、其它溶剂溶解度、稳定性（温度、ph、挥发性）、样品基质（描述、ph、主要干扰物、离子强度）、分析方法（hplc、gc、ms、内标、流动相等）、

2、初步建立方法（图都是拍照的，回头有需要的，可以留言，我发给你们）

a 样品信息
b 样品用量--检测线、固相萃取需要富集的体积等
c 固相萃取柱选择，如下图。（可以找个固相萃取柱厂家，他们都会提供给你的）

d 活化溶剂选择

e样品过柱的流速；对于中性目标物，非极性柱，1ml规格 2-10ml/min；3ml规格 3-15ml/min； 6ml规格 5-20ml/min；
对于离子型目标物，离子交换柱，1ml规格 0.5-2ml/min；3ml规格 1-5ml/min； 6ml规格 3-30ml/min；
f 洗涤干燥条件的选择；

g 洗脱溶剂的选择（自己去体会吧，嘿嘿）

3、方法优化

a 查找回收率偏低的原因--洗涤条件、洗脱条件、基质干扰、流速干扰、浓缩损失等方面
通长检测回收率低，有几个方法，添加回收率、收集洗涤液、使用多种强溶剂分别洗脱目标物；

b优化流速

c优化上样体积

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到此为止咯，下一章写固相萃取之前基质的处理，分为水样品、蜂蜜、奶、血、蔬菜。其中还有尿、谷物等没接触过就不提及了。

上班之前写一点，吼吼！最近我正在做一下肉类的样品，刚好提及一点。

目前做固相萃取，大部分都是在基质中去处理，前面也提到基质对固相萃取影响很大，这个你可别不相信，哼哼~

这个称为固相萃取前样品的前处理；

有几个目的，

a 将目标化合物溶剂在适当的溶剂；
b 通过预处理使目标物呈现特定的状态，以便和spe柱吸附；
c 调节样品的ph、离子强度和粘度；

对于水样，分为自来水、江河水、湖水、地下水、海水、废水等，处理办法不通，目前我只接触过自来水，对于江河水可能含有颗粒物比较多，海水含金属离子多，湖水浮游生物多，可能处理办法需要过滤之类的，具体去看国标吧。我这里只介绍一下自来水，自来水主要检测有机物，多环烃，联苯、酚、农药残留等。由于含量很低，需要富集500-2000ml的样品，大量水通过spe柱可能导致spe柱活性基团降低，导致萃取效果不好，因此需要在水样中加入一定比例的有机溶剂；

对于蜂蜜，粘度大，需要稀释，但是稀释的条件需要根据检测的目标物有关系；

对于奶制品，含有蛋白质、脂肪、乳糖等，一般需要沉淀蛋白，有些需要酶解；

对于食用油，粘度大，非极性强，稀释；

对于蔬菜，需要均质等，后提取，提取完要除水，在固相萃取中还要去除色谱的干扰；

基本就写这么多吧，目前对固相萃取有个展望：

1、自动化--目前自动化仪器很多，基本分为机械臂（吉尔森、agela）、阀切换（戴安、agela、caliper）等2类吧，毕竟以后人工成本原来越高，本身萃取的样品也含有剧毒的，例如黄曲霉毒素；阀切换一般价格较贵，但是处理速度比机械臂快1倍；
2、高通量
3、简单化，目前也比较流行的就是介质固相萃取，很多厂家都推出了介质固相萃取方案；
4、新型材料，纳米材料等；
5、自动化2，嘿嘿，例如很多现在spe串联LC-MS等，多种组合方式。spe串联gpc、串联高压制备等组合吧。

就写这些了，内容其实还很多，如果大家有问题就跟帖吧，尽量做到有问必答！！

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