省部重点实验室
第1楼2012/01/06
第一节 PCR基本原理和影响因素
1983年美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应(polymerase chain re
action，PCR)，1985年公开报道，使人们能在试管内以几小时的反应将DNA扩增10^9倍。
1987年PCR得到美国的专利权，PCR技术在生命科学中掀起了一场革命，并形成了巨大的市场，有人预言，本世纪末PCR产值可达到4x10^8美元。本章介绍PCR的原理、常用的各种PCR方法及主要应用范围。
一、基本原理
DNA在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。
PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。PCR的具体过程如下：
将PCR反应体系升温至95℃左右，双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性。然后将温度降至引物的Km值以下，3\'端与5\'端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合，此过程称为退火。当将反应体系的温度升至70℃左右时，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3\'端，形成新生的DNA链。每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍。理论上循环几次，就增加为2^n倍。当经30次循环后，DNA产量达2^30拷贝，约为10^9个拷贝。PCR扩增过程见图8-1。由于实际上扩增效率达不到2倍，因而应为（1+R）^n，R为扩增效率。
二、参与PCR反应体系的因素及其作用
参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR仪等。现对它们的作用介绍如下：
(一)模板核酸
用于PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。当用RNA作模板时，首先要进行反转录生成cDNA，然后再进行正常的PCR循环。核酸模板来源广泛，可以从培养细胞、细菌、病毒、组织、病理标本、考古标本等中提取。
PCR反应时加入的DNA模板量一般为100-100000拷贝，现在的技术水平已能从单个细胞制备出相应的cDNA文库。DNA模板含量合适，可以减少PCR多次循环带来的碱基错配。
通常模板DNA用线性DNA分子，若为环状质粒，最好先用酶将其切开成线状分子，因为环状DNA复性太快。
(二)引物
引物决定PCR扩增产物的特异性与长度。因此，引物设计决定PCR反应的成败。
PCR反应中有两种引物，即5\'端引物与3\'端引物。5\'端引物是指与模板5\'端序列相同的寡核苷酸，3\'端引物是指与模板3\'端序列互补的寡核苷酸。对引物的基本要求有：①引物的长度过短会影响PCR的特异性，要求有16-30bp，因为4^16=4.29x10^9，已大于哺乳动物基因组3x10^9bp，保证了特异性结合；引物过长使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74度)，亦会影响产物的特异性。②G+C的含量一般为40％-60％。③四种碱基应随机分布，不要有连续3个以上的相同嘌吟或嘧啶存在。尤其是引物3\'端，不应有连续3个G或c，否则会使引物与核酸的G或c富集区错误互补，而影响PCR的特异性。④引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp。⑤两引物之间不应互补，尤其是它们的3\'端不应互补。一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体。④引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。①引物3\'端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3\'端A影响最大，因此，尽量避免在引物3\'端第一位碱基是A。引物3\'端也不要是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。⑧引物5\'端可以修饰，包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等，引物的设计最好以电脑软件进行指导。
反应体系中，引物浓度一般要求在O.1-0.5μmol之间。浓度太高，容易生成引物二聚体，或非特异性产物。
引物Tm值与退火温度有关，计算公式为：Tm=4(G+C)+2(A+T)。引物Tm值最好在55-80℃范围，以接近72℃为最好。
(三)耐热的TaqDNA聚合酶
1976年Chien分离出热稳定聚合酶，1986年Erlich分离并纯化了适于PCR的Tq热稳定性聚合酶，为PCR成为实用技术奠定了基础，现已用基因重组生产。日前可用于PCR的聚合酶有多种：有从水生栖热菌中提取的Taq酶、从嗜热栖热苗中获得的Taq酶、从Litoralis栖热球菌中分离的VENT酶、及从酸热浴硫化裂片苗中分离的Sac酶，而以Taq酶用得最广泛。Taq DNA聚合酶分子量为94kD，75℃时酶比活性为150bs/酶分子，反应温度过高或过低均影响其延伸率，Taq蕾有很高的耐热稳定性。实验表明，在92.5℃、95℃、97.5℃时，其半衰期分别为40min、30min和5min。
纯化的Taq酶在体外无3\'-5\'外切酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。错配碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。通常，30次循环Taq酶的错配率约为0.25％，高于Klenow酶的错配率。Taq酶在每一次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000。应用低浓度的dNTP(各20μmol／L)、1.5mmol/L的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq酶的忠实性，此时的平均错配率仅为5x10^-6次/（核苷酸*循环）。
Taq酶具有类似于末端转移酶的TdT的活性，可在新生成的双链产物的3\'端加上—个碱基，尤其是dATP最容易加上。因此，欲将PCR产物克隆到载体上，可以用两种处理办法：一是构建dT-载体；二是用Klenow酶将3\'端的A去掉，即在PCR反应后，先在99℃加热10min灭活Taq酶，调整Mg2+浓度至5-10mmol/L，加入1-2U Klenow片段，室温下作用15-20min，3\'端的A即被切去，
Taq酶还具有反转录活性。在2-3mmol/L Mg2+浓度下68℃时出现类似反转录酶的活性。若有Mg2+存在，则反转录活性更佳，利用这一活性，可直接用于RNA-PCR，尤其是短片段的扩增。
以往用Taq酶进行PCR扩增，一般只能扩增小于400bp的DNA片段，经过对酶的结构与功能的改造，以及PCR方法学的改进，现已能扩增20kb以上的DNA分于。
Taq酶在PCR反应中加入的量也很重要，太少当然不好，太多一方面浪费，同时也导致非特异性扩增，通常每lOOμl反应液中含1-2.5U Taq酶为好。最好在0.5-5U范围内确定最佳酶浓度。另一个问题是，虽然Taq酶是热稳定性较好的工具酶，也应注意在-20℃贮存。
(四)缓冲液
缓冲液提供PCR反应合适的酸碱度与某些离子，常用10-50mmol/L。Tris-HCI(pH8.3-8.8)缓冲液。缓冲液中含有50mmol/L KCl有利于引物的退火。有人并加入小牛血清白蛋白(100μg/L)或明胶(0.0％)或Twen20(0.05％-0.1％)或二硫基苏糖醇(DDT，5mmol/L)等，认为这些物质可以保护Taq酶。
(五)Mg2+Taq酶的活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，Taq酶活力显暑降低；Mg2+浓度过高，又使酶催化非特异性扩增。Mg2+浓度还影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的生成等。Taq酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，而PCR反应体系中，dNTP、引物、DNA模板等中的所有磷酸基团均可与Mg2+结合而降低Mg2+的游离浓度。因此，Mg2+的总量应比dNTP的浓度高0.2-0.25mmol/L。如果反应体系中含有EDTA等螯合剂，也可结合掉一部分Mg2+。
为了获得Mg2+的最佳浓度，可用下面的优化法。首先在PCR缓冲液小不加入Mg2+，从配置的10mmol/L的Mg2+储存液中取一定量加入到各反应管中，开始以0.5mmol/L的浓度梯度递增(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,……5.0mmol/L)，由PCR反应后的电泳结果可确定Mg2+大概浓度范围，再在该浓度的上下以0.2mmol/L递增与递减几个浓度来精确确定Mg2+最适浓度。
(六)dNTP
dNTP为PCR反应的合成原料。每种dNTP浓度应相等，通常的浓度范围为20-200gmol/L，在此范围内，PCR产物的量、反应的特异性与忠实性之间的平衡最佳。例如，当每种dNTP为20μmol/L时，理论上可以产生2.6μg的400bp的DNA。使四种dNTP的浓度保持在其Km值(10-15μmol/L)以上，可保持碱基掺入的忠实性；若dNTP的浓度大于50mmol/L，则可抑制Taq酶的活性。
(七)反应温度和循环次数
1．变性温度与时间
PCR反应中变性这一步很重要，若不能使模板DNA和PCR产物完全变性，PCR反应就不能成功，DNA分子中G+C含量愈多，要求的变性温度愈高。太高的变性温度和时间又会影响Taq酶的活性，通常的变性温度和时间分别为95℃、30s，有时用97℃、15s。虽然DNA链在变性温度时两链分离只需几秒钟，但反应管内部达到所需温度还需要一定的时间，团此要适当延长时间。为了保证模板DNA能彻底变性．最好为7-10min，然后在以后的循环中，将变性步骤设为95℃/min。
扩增100-300bp短片段时，还呵以用快速的两步PCR法，即变性(94-97℃)、退火及延长(55-75℃)。
为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管内加入1-2滴液体石蜡。
2．复性温度和时间
复性温度决定PCR的特异性，合适的复性温度应低于引物Tm值的5℃。退火温度过低，引起非特异性扩增；增高退火温度，可提高扩增的特异性，因此要严格规定退火温度。退火反应时间一般为1min。
在PCR开始的头一次循环时，反应从远低于Tm值的温度开温，由于Taq酶在低温时仍具有活性，这时就可能因引物与模板非特异性配对面出现非特异性产物或出现引物二聚体 然后在以后整个PCR反应中，非特异性产物反复扩增，而使PCR严重失败。为了尽量消除这种非特异性扩增，可以使用热起动的方式，热起动方法有几种：一种方法是在PCR系统中加入抗Taq酶抗体。抗体与Taq酶结合，使Taq酶活性受抑制。因此在开始时，虽然温度低，引物可与与模板错配，但因Taq酶没有活性，不会引起非特异性扩增；当进行热变性时，抗体在高温时失活，Taq酶被释放，就可发挥作用，在以后的延伸步骤进行特
异的DNA聚合反应。另一种热起动法是用石蜡将Taq酶与PCR反应系统分隔，因此一开始在室温条件下也没有非特异性扩增。当升温到热变性温度下，石蜡熔化，Taq酶与PCR反面系统混合，从而在以后的步骤中发挥作用。使用热起动可以提高PCR扩增的特异性。
3．延伸温度与时间
延伸温度一般为72℃左右，此时Taq酶活性为每秒钟掺入核苷酸35-100个，2kb的片段用1min已足够，若DNA片段较长，扩增时间可适当延长。延伸时间过长又可引起非特异性扩增。
4．循环次数
循环次数主要取决于最初靶分子的浓度，例如在初始靶分子为3x10^5、1.5x10^4、1x10^3和50拷贝数时，循环数可分别为25-30、30-35、35-40从40-45。过多的循环次数会增加非特异性产物量及碱基错配数。PCR反应后期，扩增产物的增加并不成为指数方式，称为平台效应。平台效应可能与下列因素有关：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，多次循环后酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸。
(八)PCR仪
有多种进口与国产PCR仪。仪器的升降温方式可有气体加温、水加温及电热块加温等。温度、循环次数及时间等参数现多用电脑控制。可根据需要选择仪器。
由于PCR方法高度灵敏，少量的靶分子即可扩增至无限数。因此要防止PCR扩增产物污染环境而引起以后的PCR假阳性。为此，应将PCR仪及PCR产物检测等过程与标本制备及PCR反应管的制备尽量在空间分开，最好在不同的房间进行。通常可将实验空间分为标本处理区、反应混合制备和PCR扩增区、产物分析区等。`
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第2楼2012/01/06
第二节 常用的几种PCR反应
PCR问世后，由于其很高的实用性而被广泛采用。而方法本身又在使用中不断地得到创新与发展，形成了一系列的适用于不同目的的特殊方法。现将常用的几种介绍如下。
一、反转录PCR(RTPCR)
二、定量PCR
三、碱基替代PCR
四、彩色PCR
五、重组PCR
六、不对称PCR
七、膜结合PCR
八、固着PCR
九、原位PCR
十、反向PCR
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第三节 PCR在分子生物学中的应用
一、用PCR制备cDNA文库与筛选
二、PCR直接测序法
三、PCR用于染色体区带特异片段克隆
（一）随机引物PCR
（二）散在重复序列PCR
四、检测突变碱基
五、用简并引物法扩增未知序列
六、用PCR标记DNA探针
七、PCR与新基因的寻找
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第四节 PCR在临床医学中的应用
一、病原体检查
二、遗传病的基因诊断
三、肿瘤的诊断、转移确定
四、PCR用于组织器官移植的配型选择
5.3 基因芯片分析技术
一、基因芯片分析技术
1 基因芯片的概念
基因芯片，亦指DNA微阵列，是将大量DNA片段有规则地固定在某种介质上，从而检测特定基因表达地一项技术。这项技术的基本原理是分子生物学中常用的杂交方法的扩展，其基本做法是将要检测的样品加以标记，然后与做成的阵块进行充分杂交，再加以洗脱后，用图像显示出结果。这里，在阵块中排列的DNA片段应是已知的序列。根据这种概念，我们可以看出，在这项技术中，有如下三点是非常关键的。
其一，要有大量已知序列和基因片段。随着人类基固组计划的实施，我们可以得到
大量基因序列信息，可以将一个文库的所有cDNA序列测到并加以记录，从而可以将一个文库排列成一个DNA阵列。因此，从理论上讲，可以做成从微生物到人类各组织器官的文库阵列。其二，从工艺的角度讲，要求能够将不同的DNA片段以很高的密度“点印”在普通载载玻片大小的介质上，从而使得在很小的面积上可以排列成千上万个基因而不致于相互混杂，这个过程要求相当高水干的工艺技术。其三，要有—种很好的检测手段。目前看来，用不同的荧光标记核酸来进行检测是一种比较简单，而且安全可靠的方法。同时，不同的荧光可以使得我们同时检测几种样品。这样，对于差异显示这类实验来说，就显得尤为简便。
基因芯片一股可分为两处，一种为“点印”阵列，一种为直接合成阵列。“点印”
阵列是将较大的片段（大于100bp）物理地固定在介质上，而直接合成阵列则是直接在介质上合成较短的片段。一般而言，DNA样本都是收集在96孔或384孔板上，这些样本可以是PCR产物，也可以是从质粒上直接得到的片段等。然后用机械手将DNA通过特制的加样头进行点样。点样完成后，对介质进行处理以使DNA能够十分稳定地附着在介质上，同时还要使介质尽量减少结合非特异性的探针。
2 基因芯片的操作过程
基因芯片制作从准备探针(即扩增DNA片段)开始，经过芯片加工、DNA阵列点印、芯片后处理及芯片质量检测等过程，其应用包括RNA制备、标记、杂交及成像分析。因此．基因芯片的应用包括了制作工艺过程和基因表达分析过程。
2.1 准备DNA 作为基因分析，DNA片段是最基本的材料，也是基因芯片制作的关键。对于不同的阵列，可以选择不同的目的BNA。
2.1.1 目的DNA的选择 对于大规模地研究基因表达问题，需要分析每一个基因的表
达。因此，选择的目的 DNA必须能够代表要研究的各个基因。对于整个基因组序列全部已知的生物，最直接的方法是用PCR扩增基因组中每个已知的或预测的开放阅读框架(open reading frame)，亦可以选择自己感兴趣的部分序列。
对于没有测序，或只有部分测序的基因组，或者对于那些有大量内含子的基因组，
上述方法就不现实。在这种情况下，我们首先考虑采用表达序列标记(EST)。可以将单个EST的cDNA克隆用作阵列DNA来源。对于还没有基因组测序计划或序列还未知的生物，可以利用DNA文库作为DNA来源。当然这种文库最好是经过归整化处理，以减少不必要的冗余。
用作阵列的DNA可以呈双链的，亦可以是单链的。但是其长度最好是小于开放阅读框架，或小于1 000bp的cDNA。这对于很多具有同源性的基因尤为重要。当基团之间具有很高同源性时，最好选择基因之间有差异的部分，这样便可以提高基因之间的分辨度。所以，在考虑每个基因代表性的同时，应充分考虑所研究问题的具体情况。
2.1.2 PCR扩增 一般而言，100μl PCR反应体系得到的产物足以点印1000个基因芯
片。PCR通常是在96孔PCR仪上进行，实际扩增的反应条件要根据所用的模板从引物来确定。但要尽量减少PGR反应体系中的组分，尽量只用模板、引物、核苷酸、镁离子、标准缓冲液和酶。不要用甘油或明胶，它们往往会粘附在阵列块上而影响以后的点样工作。
2.1.3 点样前DNA准备 点样以前，要将PCR产物清洗纯化干净，并且对DNA进行一些处理，一般用异丙醇沉淀PCR产物，以除去酶、离子及核苷酸等。沉淀后用70％乙醇洗1次，再用95%乙醇洗1次，待完全干燥后，将所沉淀DNA重溶在3XSSC中，其浓度掌握在100ng/μl 左右。由于处理的样本量很大，一般直接在96孔板上操作，可选用能够配置96孔板的离心机（如Savant Speed Vac Plus SC210A）。当把DNA溶于10～15μl 3×SSC(pH7.0)中后，最好置于4℃至少12h。然后，将DNA溶液封存在 -20℃～4℃。
当然，纯化DNA的方法多种多样，使用者可以根据自己的情况选用。在此应当强调的是，在最后得到的DNA样本中，应尽量减少其它污染，尽量除去盐类、去污剂、甘油、明胶以及树脂颗粒等。具体实践中，应当用小规模DNA样品进行点样测试．待确定效果后，再大规模制作。
2.2 准备载物片 载物片是要将DNA点上去的支撑物，有不同的材料，通常用载玻片
。DNA并不能直接固定在玻璃表面，固此需要对玻璃表面进行处理。有很多方法可以处理玻璃表面，但是我们认为用多聚-L-赖氨酸比较简单可靠．
首先充分清洗载玻片，用25XNaOH溶液200ml加300mi 95％乙醇配成500ml碱性清洗液，将载玻片彻底浸泡在清洗液中2h，再用清水冲洗5遍井将载玻片泡在水中。接下来就是用多聚-L-赖氨酸溶液浸泡，从而使多聚赖氨酸均匀涂包在玻璃表面，形成一种多聚-L-赖氨酸涂面。具体做法是配成350mI多聚-L-赖氨酸浸泡液，将洗净的载玻片直接浸泡，浸泡期间保持慢速摇晃，Ih后取出并在水中浸泡清洗，最后干燥。一般将涂好的载玻片用锡箔纸包好，室温放置1个月，进行熟化，以使表面保持充分的疏水性。这对于以后点DNA样品是十分重要的。
2.3 基因芯片的点印 点印DNA用机械手。将一组处理好的载玻片固定在一个平台上
，将DNA样品(溶在3XSSC中)装在96孔或384孔的平板中，并将平板放在支架上。机械手将一组特制的点样吸头插入对应的DNA平板孔中，让每个吸头充上约1μl的DNA溶液。然后机械手轻轻地将吸头移向载玻片，将DNA样品完全一致地点到多聚-L-赖氨酸包被的载玻片面上．每个载玻片上大约点<0.5μl的DNA溶液，故理论上一次可以点印2 000个载玻片。待这一组DNA样品点印完成，机械手清洗点样吸头，开始第二批样品的点印。点样的质量要表现在点与点的距离，这取决于点样吸头的尖锐度与多聚-L-赖氨酸表面的疏水性。—般情况下两个点中央间距为100μm，点间空100μm。如果点间空为200μm，就可以把整个酵母基因组点印在1.8cm2大的面积上；如果点间空为100μm，可以把人类75 000个基因全部点在一张2．54cmX7．62cm的普通载玻片上。目前，每个点样循环持续大约为2rmin，包括清洗、干燥、加样和点样，一般点110张片子。如果增加点样吸头数，可以缩短点样时间。如将点样吸头增加到32个，则完成110个载玻片的所有人类基因点样工作约需2天时间。
2.4 基因芯片的后加工处理 当一个基因芯片点成之后，需要对其进行进一步的加工
处理，以便能够用于以后的杂交实验。通常进行四步处理，即重新水合化及快速干燥、UV-交联、封闭及变性。
2.4.1 重新水合化 通常点样过程并不能保证DNA在点中均匀一致。为使DNA在所有点中都分布均匀．需要对之进行重新水和化并进行快速干燥。这一过程要求技术条件很高。当重新水合化不充分时，大小不规则的点会影响以后的杂交与分析结果。但当过度水合化时，点与点之间可能会产生融合。因此，要确定一个十分准确的水合条件，一般用蒸汽熏润，其时间、温度需要摸索。
2.4.2 UV交联 当重新水合化并立即干燥后，将载玻片放在UV射线下照射，这样可以使DNA交联在载玻片上。这一过程对于DNA浓度低时尤为重要，可以增加可杂交DNA吸附到每一个点上的量．在UV交联时，将载玻片有DNA点的面朝上，照射总能量强度为60mJ即可。
2.4.3 封闭 封闭的主要目的是将游离赖氨酸基团加以修饰，以避免这些基团与以后
被标记的DNA结合。如果不对载玻片封闭，那么，将来杂交后就会产生无法分清的非特异杂交斑．而且还会产生过多的背景。一般的封闭办法是用琥珀酸酐进行酰基化，将赖氨酸的氨基转化成酰氨基，使之形成负电荷表面，从而减小与DNA的非特异结合．这一过程一般在15min内结束。
2.4.4 变性处理 当封闭过程完成后，要立即进行变性处理，即将整个载玻片立即浸
入沸腾但不冒泡的水中，上下翻3～5次，停留2min，然后立即转到95%的乙醇中，浸泡一会儿后离心干燥，这样便完成了对芯片上DNA的变性处理。此时，整个基因芯片块也就做好了。
3 基因芯片的使用
基因芯片块制作好后，关键就是用它来完成特殊的实验。其基木原理就是将研究的
细胞或组织RNA加以标记，与基因芯片块上所点印的基因片段进行杂交，从而探测特定基因的表达。
3.1 准备探针 与传统的Northen Blot正好相反，这里我们将所以表达的RNA作为探
针来源。所以探针的准备工作要包括RNA的提取和标记。
3.1.1 RNA的提取 提取RNA的方法很多。现在市场上有很多提取RNA的试剂盒，用起来十分方便。不管用什么方法，提取RNA的质量和产量是问题的关键。对于研究基因表达的实验来说，最好应用纯化mRNA作为反转录模板。如果用荧光cDNA探针，需要至少1μg的mRNA或100μg总RNA。
3.1.2 标记 从RNA制作标记探针，其方法有好几种，最多情况是在Oligo-dT引物进
行的逆转录反应中直接掺入荧光素标记的核苷酸。有时候也可以用随机引物cDNA合成法标记。一般基因芯片中片段来自基因3\'端时较适宜用Oligo-dT引物cDNA探针，而基因芯片中片段来自全长cDNA序列或预期开放阅读框架时用两种方法均可。亦可在第一链cDNA合成后再行标记。关于两种标记方法可参考有关手册。
3.1.3 荧光染料 目前市场上可以买到许多荧光染料标记的脱氧核苷酸，特别是用C
y3和Cy5标记的dUTP。这两种染料在光谱上分得很开，而且对于许多酶都有较高而特异的掺合活性。当干燥后，荧光强度很亮，可以放大成像效果。除此之外，R110(Pekin Elmer)，TAMRA(Pekin Elmer)和Spectrum Orange(Vysis)的效果也比较好。
3.2 杂交反应 与昔通的Northern Blot相比，基因芯片杂交反应过程显得十分简便
。即将标记好的探针样品经高速离心去除一切沉淀物后只用移液器滴在基因芯片的中央即可。在其过程中应尽量避免产生气泡及带进沉淀杂质。滴好后在载玻片DNA阵列部位上方放一盖玻片，然后在周围滴上3滴5μl的3XSSC溶液以保持杂交池中的湿度。最后将载玻片用塑料膜包起来放到65℃水溶中杂交4~1 6h。
3.3 杂交后处理 和Northern Blot一佯，杂交完成后要进行清洗，以除去剩余的探
针。清洗的方法是用2XSSC、0.1%SDS溶液浸泡，然后用1×SSC浸泡，最后再用0.2XSSC清洗。但是，应当注意，整个清洗过程都在室温下进行。清洗的时间也要严格把握。
3.4 试验设计 由于基因芯片可以容纳很多信息，所以在使用时要充分考虑试验设计，要合理设计各种对照，以便在分析结果时能得出正确的结论。
3.4.1 异种RNA平行实验 为了检测探针标记等过程，可以利用异种生物的RNA进行平行实验。对于人类基因阵列，可以用酵母的基因进行平行实验。选择异种基因时应避免与所研究基因有同源性，从而不致于产生杂交，但要求在DNA性质上(如GC含量、长度、poly-A尾端等)基本相似。可以选择上百个这样的异种基因，点印在所研究的阵列上。将这些基因除了点印在阵列块上以外，还要将它们克隆到带有噬菌体RNA聚合酶结合位点及人工poly-A尾端的质粒上，从而扩增大量的RNA。利用这种RNA作对照，分别标记Cy3和Cy5，可以检测正式实验中Cy3与Cy5的比值，亦可检测杂交的反应程度，同时还可作为输入输出比率的校正以及分析的灵敏度。
3.4.2 RNA质量检测对照 一定核酸序列的DNA片段与相应基因结合的量，受其共同区域大小的影响。因此，对于一定的cDNA进行杂交。时的信号强度，就会因RNA的质量而发生变化。这就会使基因芯片杂交的结果产生混淆。例如，当RNA质量不同时，由之合成的相同量的cDNA在比较时就会产生明显差异，在分析时就不能得到1:1的比率。这个问题可通用选择合适的序列片段来解决。例如，用Oligo-
dT引物cDNA探针时。如将序列片段限定在基因的3\' 端，就可防止产生偏差。一般可以按照下列方法来检测RNA的质量。将—个整个基因按100-200bp分段，每一段都点印在基因芯片块上，然后杂交不同样品RNA后检测该基因的信号。如果RNA在某一区段降解时，就不能检测到该区段的信号，由此可以断定所用RNA的质量。亦可用以上平行实验中的RNA在每一步来检测该基因各个片段的表达，从而确定各个步骤中RNA是否降解。这里最关键的几步是收获细胞、mRNA分离提纯、探针标记和杂交。
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