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荧光分析法

  • 省部重点实验室
    2012/02/22
  • 私聊

生命科学仪器综合讨论

  • 荧光分析法
    一、概述
    1.定义:
    化学发光 原子荧光(x-荧光),测痕量元素
    光致发光
    分子荧光 测痕量化合物,在常温和低温下测定
    2.特点
    (1)灵敏度很高:一般10-9~10-12g/ml,诱导激光10-19g/ml。
    (2)线性范围宽:3~5个数量级。
    (3)选择性好(比紫外好)。
    (4)信息量大:F—λex, F—λem, F—λex—λem, F—△λ(λex-λem)。
    (5)仪器操作简单(类似紫外)。
    3.应用情况
    (1)有天然荧光物质,可用直接荧光法;
    (2)无或弱荧光的物质可用衍生物荧光法;
    (3)可使荧光熄灭的物质,可用荧光熄灭法;
    (4)发光寿命不同的物质,可用时间分辨荧光法;
    (5)荧光光谱严重重叠的物质,可用同步扫描荧光法;
    (6)作为HPLC的常用检测器。
    二、荧光的产生
    λex -ν 第一激发单线态最低振动能级 F(λem)基态单线态多振动能级
    (1)λem>λex;
    (2) F—λex和F—λem区别:前者可有几个峰,后者只有一个峰;
    (3)F—λex和A—λ曲线相似,λex可由A—λ曲线上找,用最强λmax作激发波长λex
    (4)选λex(max)和λem(max)作为光谱条件 定性
    定量 ——最灵敏的一组波长
    (5)F—λem曲线的形状与λex无关,F与λex有关。
    (6)物质发光的必备条件 吸收较强:UV-Vis光
    荧光效率φf>0。
    (7)引起荧光的分子结构因素:n—π共轭体系
    刚性和平面性结构:取代基少
    取代基性质 φf增大:杂原子饱和基团
    φf减小:不饱和杂原子基团 :—CO—、—NO2、—COOH、重离子如—I、—Br
    (8)荧光测试——提高灵敏度和选择性 测无机离子(配合物)
    测有机离子
    三、影响F的外因
    1.温度:T增高,φf下降;
      2.溶剂极性强,荧光效率φf增大,一般在水或醇中测定;
    3.酸度:有机酸、碱的结构与PH有关;
    4.荧光熄灭(Q)剂的影响:
    (1)M*与Q碰撞失去振动能;
    (2)M与Q形成配合物;
    (3)M*与Q碰撞发生电荷转移,M*电荷转移,λmax改变;
    (4)M*与Q碰撞发生电荷转移形成Q→Q*;
    (5)重原子效应:M*(单线态)→M*(三线态);
    (6)顺磁性物质:溶解O2;
    (7)自熄灭现象(浓度比较高:1g/L);
    (8)其它分子强烈吸收λex;
    5.表面活性剂影响,形成胶束使M*固定,分散于其中。φf 增大→胶束荧光分析;
    6.散射光: 瑞利光:λem=λex;
    拉曼光:λem>λex,干扰荧光。
    溶剂分子或荧光分子吸收了光子的部分能量(分子振动能),光子能量下降,λem↑
       Eex-Eem=△E振动(与分子性质有关)
    溶剂的拉曼光:1/λex-1/λem=10-7ū(cm-1) 1/λem=0.9975×(1/λex)-3.350×10-4,ū水=3350cm-1(r=0.9999992)。
    消除拉曼光干扰的方法:
    (1)选择合适的λex,使λRm和λem不重叠;
    (2)从样品F值中减去空白的拉曼光(F0);
    (3)改换溶剂。
    四、F—C关系:
    一定的λex和λem下,F=K‘×φf×(I0-I) K’为仪器参数;A<0.05时,F=2.303 K‘×φf×I0,测定相对误差6%。
    F决定 内因:φf、E
    外因:K‘、I0是荧光法比uv法更灵敏的原因
    A=KC=-lg(I/I0)
    五、定量分析方法:测荧光时使用一个池。F=KC: 作灵敏度校正
    空白荧光
    1.标准曲线法
    (1)性质稳定的基准物 标准物 校正仪器灵敏度 100
    被测物 50
    (2)空白荧光的扣除: 将空白调到F0=0,再测样品F;
    测空白的F0>0,再测样品F,F-F0=KC
    对照品和样品的空白不同,同时测Fs0、Fx0作对比,Fx-Fx0=KCx Fs-Fs0=KCs。
    (3)标准曲线:F-F0=KC(r>0.999)
    2.比例法
    一般公式:(Fx-F0)/(Fs-F0)=Cx/Cs
    特殊情况: Fx/Fs=Cx/Cs
    F0=∑Fx0 Fs0 (Fx-F0)/(Fs-F0)=Cx/Cs
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  • 省部重点实验室

    第1楼2012/02/22

    六、仪器
    1.类型:
    (1)滤光片荧光计:作定量分析(F—F0)—C曲线
    (2)滤光片光栅型荧光分光光度计 F—λem曲线定性
    (F—F0)—C曲线定量
    F—λem 定性
    (3)双光栅型荧光分光光度计 F—λex
    (F—F0)—C曲线定量
    2.样品池:
    (1)λex<360nm,石英池
    (2)λex>360nm,玻璃池
    3.仪器校正:灵敏度校正;波长校正;激发光谱和荧光光谱的校正
    七、荧光新技术
    1.激光荧光分析:I0大;2.时间分辨荧光法——免疫分析;3.同步扫描荧光法;4.胶束增敏荧光法。

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