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[转帖]：梯度洗脱时应该注意的一些问题

瓢虫

2006/04/12

液相色谱（LC）

在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此必然带来一些特殊的问题，我们必须充分地重视。

1、要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵（pH5.16）做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

2、梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辩认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头上后会被强的溶剂洗脱出来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止溶剂混合时产生气泡。

3、混合溶剂的粘度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。

4、每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始的状态。需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡！

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瓢虫

第1楼2006/04/12

还有一个问题需要注意：在进行梯度前，一定要在不进样的前提上跑3-5次空的梯度。确保没有杂质峰或者是鬼峰，并让系统彻底平衡好。

0

lenovο

第2楼2006/04/12

很好，希望每个做分析的和做销售、维护的都认真看看。

0

shaweinan

第3楼2006/04/12

内容不错，是一些做液相的人应该知道的知识。

0

zhang_yidong

第4楼2006/04/12

　　一定好好学习。

0

yuhang3650

第5楼2006/04/12

thank you so much

0

huangwm007

第6楼2006/04/13

学到东西了，谢谢。色谱柱怎么进行再生处理啊？这位老师

0

jjwen

第7楼2006/04/19

正好用得上最近，但是我看有人做梯度好像也没有平衡很久的时间
liang_sp 发表:在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此必然带来一些特殊的问题，我们必须充分地重视。

1、要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵（pH5.16）做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

2、梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辩认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头上后会被强的溶剂洗脱出来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止溶剂混合时产生气泡。

3、混合溶剂的粘度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。

4、每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始的状态。需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡！

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juegen

第8楼2012/08/11

还有一个问题需要注意：在进行梯度前，一定要在不进样的前提上跑3-5次空的梯度。确保没有杂质峰或者是鬼峰，并让系统彻底平衡好。

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