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酶免疫电镜的操作步骤
童话仙子
2012/03/25
私聊
生命科学仪器综合讨论
1
.酶标抗体的制备
2
.取材
将培养细胞或悬浮细胞用
0.1Mol/L PBS
液冲洗,离心沉淀后,立即转入固定液
(2%
甲醛液或
2%
戊二醛液均可
)pH 7.2
,
4
℃固定
5min
~
30min(
依抗原性质所定
)
。如病料为组织块,则取适当大小,先固定
1h
然后取出,以新的双面刀片切成
50
~
100µm
的薄组织再行固定
1h
~
2h
。
3
.漂洗
以
PBS
液漂洗过夜,换液
3
~
4
次。
4
.血清孵育,
25
℃
1h
或
4
℃过夜,孵育的标本放置于加盖的瓷盘内,底层垫数层纱布。防止抗血清干燥凝固,不易洗脱,造成非特异性吸附。
5
.
PBS
冲洗
3
~
4
次,每次
10min
。
6
.
2.5%
戊二醛再固定
15min
~
30min
。
7
.
PBS
液冲洗
3
~
4
次每次
10min
。
8
.酶标记抗体孵育;用适当稀释的酶标抗体
(
即工作浓度
)
于
25
℃湿盆内孵育
1h
或
4
℃过夜。
9
.
PBS
液冲洗
3
~
4
次每次
10min
或
4
℃漂洗过夜。
10
.酶显色处理
将漂洗后的标本浸入
DAB
-
H2O2
底物溶液中,
20
℃,
10min
~
30min
。显色强弱与戊二醛的固定有关。若显色弱则可减少甚至取消戊二醛的固定时间。冲洗时必须注意防止非特异漂浮的沉积。
11
.常规包埋、切片、电镜观察
在经过脱水包埋确定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做标记染色,切片一般在
2µm
~
4µm
,切片后染色不存在通透困难的问题。无论在标记染色后切片还是在切片后标记染色,最好在光镜下定位选择后,再做电镜定位包埋,这样目的性强,可减少工作量。
分
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私聊
童话仙子
第1楼
2012/03/25
上述的这个操作步骤就是一个标准的SOP操作规程了的,期望对于各位筒子们有所帮助哦
0
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