生物质谱技术在细胞生物学中的应用

样品分离与蛋白质显色技术



二维聚丙烯酰胺凝胶（2DPAGE))电泳仍然是分离大量蛋白质最有效的方法, 但是, 对于质谱分析而言，2DPAGE并非总是需要的，尤其是对于某些膜蛋白、具有较高PI值的蛋白和溶解度较差不能进入2DPAGE第一相的蛋白质。实际上,根据MS鉴定混合蛋白质的能力，以我们的经验在许多情况下用1D SDS-PAGE胶就能够满足要求，有时对于复杂蛋白质样品如细胞器蛋白质组的鉴定甚至是非常有利的。例如,我们用1DSDS-PAGE分离了用表面活性剂提取的小鼠肝脏中高尔基体制备物，然后鉴定了80多个蛋白质。某些情况下,尤其当用LC-MS/MS时，可直接分析复杂混合物而不用预先用胶进行分离.

传统上,1D或2DPAGE胶上蛋白质用³⁵S 放射性标记显色或用考马斯亮蓝或银染，最近高灵敏度荧光染色已经得到应用。这些方法中有一些不适于质谱进行蛋白质鉴定，为了适用质谱鉴定，银染技术必须被改进以去除交联剂。下面我们将讨论适用于质谱技术的染色方案。另外为了避免污染物的引入，在实验中必需选用优质的试剂，同时操作时必需带手套，塑料器皿应该一次性使用或至少要清洗和专用。

下述方法中胶体考马斯亮蓝染色快速，价廉,几乎能够达到银染的灵敏度。首先，在2%醋酸/40%乙醇（V/V）中固定胶1小时，在此过程中一定要注意避免污染胶的表面，接着用5倍的水稀释胶体考马斯亮篮浓缩液，混匀配成50ul的溶液，取出10ml溶液，再加入10ml甲醇替换之。染色至少1小时后可得到初步的结果，而过夜染色可得到更理想的结果。染色后的胶用5%醋酸/25%乙醇溶液简单地冲洗，然后在25%甲醇溶液中脱色不超过1小时，最后把胶置于水中，在4 ℃下胶至少可保存几天以备下一步的质谱分析。我们还发现用商业胶染色仪器（Genomic Solutions Ltd.,St.Neots,UK）时能得到低背景的结果，尤其是当大量胶需要染色时。

我们所用的银染方案是根据Shevchenko等人改良的方法。首先，在50%乙醇/5%醋酸溶液中固定胶1小时，然后再用50%甲醇过夜浸泡洗胶，用水洗胶3×10min去除残余酸，并在0.02%（w/v）的硫代硫酸钠中浸泡2×15min.增敏，之后用冷水洗3×10min。然后室温下浸没在1%的冷硝酸银溶液中1-1.5h，除去硝酸银后用水洗2×1min。在含0.04%甲醛的2%碳酸钠液中展开，当溶液变黄以后除去展开剂，并用新鲜的溶液代替，让胶继续展开，最后去除展开剂并用5%醋酸洗胶，保存胶于1%醋酸溶液中。

在http://protana.com/services/protocols/default.asp.中可找到更多的能满足MS分析要求的染色方法。



　

蛋白质鉴定

用MS鉴定蛋白质的多数方法中，或经过1D或2D胶分离或不经分离直接鉴定，首先都需要蛋白水解酶的酶解，最常用的酶是胰蛋白酶，它是一种序列特异性的蛋白酶，只切割精氨酸或赖氨酸残基的C端。从胶上切下用于酶解的体积尽可能小的胶带，随后再将胶切成约1mm³的小块放于小离心管中。下面的步骤是根据Wilm等人发表的方法而来的。用100mM碳酸氢氨(一个2D胶斑点~50ul)洗胶块5min，之后除去缓冲溶液，加50ul乙腈并使胶脱水10-15min。如果胶块没有完全脱水就需要再换一次乙腈，最后倾出乙腈，在Speed-Vac 中完全干燥（在低温状态~15min）,用50ul含有10mMDTT的100mM碳酸氢氨溶液（新鲜配置）再水化胶,在56℃下加热30min还原样品，之后倾出DTT溶液，加乙腈于胶中15min后在Speed –Vac 中干燥（低温 15min），加50ul含有55mM碘乙酰胺的100mM碳酸氢氨溶液烷基化半胱氨酸残基，避光在室温下放置20min，弃去上清液用100mM的碳酸氢胺缓冲液冲洗，然后换用新的碳酸氢胺缓冲液洗15min,如果这一步还不能完全脱色，需用100mM碳酸氢氨：乙腈1:1的溶液在37℃振摇30min，重复此步骤直到完全脱色。倾出液体加入50ul的乙腈约15min后，在Speed-ac 中干燥,再在50mM包含测序级胰酶的碳酸氢氨溶液中再水化。酶的储存液是在25ug的胰酶中加250ul的0.1%三氟乙酸。每份(15ul)被储存在4℃下。活性酶溶液的制备是每份15ul加100ul的50mM碳酸氢胺溶液,终浓度是13ng/ul.。加入约20ul的胰酶溶液于胶块中（充分再水化后的胶块）并放置在4℃下再水化45-60min，移走过量的胰酶溶液加入少量的 50mM的碳酸氢胺溶液(10-20ul)使胶块在酶解过程中保持浸润，在37℃孵育1小时，然后在室温下过夜。

下一步样品处理是根据不同质谱鉴定方法来决定，主要有三种鉴定技术按照被鉴定蛋白难易度而依次应用. MALDI-TOF是一种最有效的鉴定技术,它可通过肽指纹图谱（PMF）来鉴定蛋白质。用这种技术检测胰酶酶切后的肽质量数有很高的准确度（达到100ppM或更高）,可与理论上预测的胰酶对蛋白酶切后所形成的一系列肽质量数比较（数据库查询）。由于大多数肽段只带一个电荷，在谱中以单峰的形式存在，因此MALDI-TOF MS数据很容易解释。对于基因组序列已完全确定了的生物体如Saccharomyces cerevisiae 和Caenorhabditis elegans，这种技术尤其有用，因为所有被胰酶酶切后生成的多肽质量数可以用一个封闭的数据包准确预测。MALDI-TOF（带反射功能）能够通过源后延迟PSD功能获得肽序列信息，然而这种技术要求样品的初始量至少达pmol，且质谱图不如传统的MS/MS 好解释。MALDI-TOF，与其它下面将讨论的技术不同，分析蛋白混合物和确定混合物中所有单个组分的能力较差。尽管如此，但是通过反复搜寻仍经常可从MALDI-TOF数据中鉴定出2~3个蛋白质。作为应用MALDI-TOF的一个例子，在下面介绍用该方法鉴定酵母中p24蛋白。分析蛋白酶解物，是根据Jensen 等（14）改良的方法。在该方法中，先将5%甲酸点到预先涂好基质的不锈钢靶上，然后将与甲酸等体积的酶解上清液直接加样于靶上进行测定。该方法用于微量多肽更为灵敏，但不适合源后裂解，因为靶的表面样品含量很快就会削减.

新鲜配制10mg/ml的a -氰基-4-羟基肉桂酸于丙酮/2-丙醇（1:1v/v）中，以 4:1的比例和硝酸纤维素[10mg/ml在丙酮/2-丙醇（1:1v/v）]混合。点约0.3m l 基质混合液于靶上，需将基质经蒸发保持成薄层（膜）。很小心地加0.3m l 5%甲酸于靶上，然后再直接加0.5m l样品。让靶自然干燥。用5%甲酸洗靶（~1m l/靶）。用高压气体吹干过量的洗液，最后将靶装入质谱仪。

如得不到完整的序列信息，或当MALDI-TOF 分析不能确定时，需要采用电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）来获得确定的序列信息以用于数据库的检索，或用于克隆实验。当应用MS/MS分析时，首先选择要测序的肽离子再由碰撞诱导解离（CID）得到其碎片离子，由CID得到的肽的碎片离子可以从图1得到很好的说明。如果采用ESI-MS时，胰酶酶解的肽通常得到的是双电荷分子离子，这是因为分子的每一个末端都是最可能的质子化位点，任何骨架键的断裂均可产生两个单电荷序列离子碎片，由骨架键断裂产生的离子如果电荷在N末端,碎片被定义为a，b，c，如果电荷在C-末端被定义为x，y，z, 通常在低能量裂解情况下，不产生c和z离子，a离子是b离子失去CO(28Da)得到的。骨架键断裂还可能得到immonium离子和acylium离子。Acylium离子是由两个骨架键断裂后形成的。离子m/z值高于母离子的通常为y离子系列，在许多情况下, 从y离子系列可以得到部分序列信息，这些信息是数据库检索的基础。

纳升电喷雾（纳升流速的ESI）是基于Wilm和 Mann的理论研究，现在已经发展成为分析从1D和2D上分离得到的微量蛋白质的有利工具。蛋白质在胶上酶解后得到的酶切肽段样品1ul，经被拉伸成超微孔点的玻璃或石英针孔喷雾而出，一微升可以喷1小时或更长的时间，这样，在温和能量碰撞下可重复进行许多次MS/MS实验。与快速数据库检索相联，可进行实时蛋白质鉴定。在同次喷雾中，还可进行进一步的确认实验，或对复杂混合物组分深入研究，另外，通常在三级四级杆质谱仪器中，这种方法可以通过母离子扫描来分析翻译后修饰如糖基化。最初磷酸肽和糖肽是基于从CID得到的特殊信号离子来鉴定的。所有的肽离子都有序地进入碰撞室，但是质谱所记录的是那些产生感兴趣的信号离子的母离子。举个例子，选择作为子离子（PO3-）的m/z79作为磷酸肽的指示物，它们的母离子被裂解以确定磷酸化位点。纳米串联质谱是相当灵敏并在鉴定生物学重要复合物时发挥着关键的作用。纳米喷雾接口可用在许多商业电喷雾质谱仪中。专用细针可通过已商业化设备（puller）牵拉而成 (Sutter Instruments Novato,CA,USA)或购自现成产品（Protana A/S; New Objective Inc.,Cambridge,MA;Micromass,Manchester,UK）。

样品上样进行质谱分析的另一个方法是用在线LC-MS/MS，即在电喷雾接口前采用HPLC分离多肽。当多肽从色谱柱中流出时,质谱（Q-TOF,Micromass,Manchester,UK）自动选择母离子进行MS/MS分析。为了保证灵敏度,75到180um大小的柱子采用低流速。这个系统比大孔径柱难于维护,但是一旦得到一个稳定的配置，他们将显示非常强大的功能. 在线方法有几个优点, 包括高灵敏度、在线脱盐和自动化等。当然每运行一次产生的几百个MS/MS图谱是相当大的文件（超过1Gb），但是相应软件的出现使得预先不需对数据做任何说明就可以对完整的运行过程进行自动分析, 而且数据库检索的速度已不成问题，能够在几分钟内就得出所有检索的结果.

纳米电喷雾和在线LC-MS/MS两种方法是相互补充的，各有优势。例如，纳米电喷雾更适于全新序列的分析（de novo sequencing)，可以对非常复杂的混合物进行蛋白序列分析，而在线LC-MS/MS几乎可以达到无人操作的自动化程度(unattended operation)。许多测序实验室同时使用这两种方法。在下面我们将介绍因样品不同而采用不同技术的策略.


　

数据库查寻

灵敏和快速的检索方法是推动生物质谱在细胞生物学中应用的最重要进展之一。目前已有若干程序都可通过质谱结果进行蛋白数据库的检索，这些质谱数据包括肽质量谱、肽段质量数和（部分）氨基酸序列等。本文不对上述软件做详细综述，仅列出一些可通过肽质量数和部分序列信息进行检索并已被广泛应用的蛋白质数据库的互连网地址（见表1），在本地安装软件包可增加数据安全并提高查寻速度。

任何数据库，包括基因组数据库，原则上能用肽质量数和序列标签数据查寻（21）。为加快速度，有的程序对数据库先作予索引，而其它程序（通常使用多个程序或贝奥伍尔夫簇（Beowulf clusters））可以直接处理原始序列数据而不影响操作。应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST数据库。NRDB由SWISSPROT和GENPETP等几个数据库组成。dbEST是由国家生物技术信息中心/欧洲生物信息学研究所（National Centre for Biotechnology Information/European Bioinformatics Institute NCBI/EBI）共同编辑的核酸数据库，包括许多生物体的表达序列标签。dbEST库目前（2000年2月4日）包括3,569,075个条目，估计代表~80%人的基因。用肽序列标签或部分序列信息最适合查寻dbEST库，而大多数情况下用肽质量数是无效的。虽然也有用单个表达序列标签完全代表小蛋白的例子，但表达序列标签（ESTs）仅含有几百个碱基对，只能覆盖很少的胰蛋白酶酶解肽段。在dbEST库中，~2-5%的序列错误率也会阻碍鉴定。最近已有报道强调用质谱数据查寻dbEST库以便鉴定生物学家最感兴趣的以前未表征的蛋白质的重要性（20）。例如，Neubauer 等（25）讲述了对哺乳动物剪接体（Spliceosome）组分的全面鉴定。他们用双向电泳分离和纳升电喷雾质谱测定鉴定后，使用公共EST数据库克隆了新的组分。该方法的成功有力地说明人类EST数据库已能满足用质谱数据快速表征哺乳动物多蛋白质复合物的要求。

当然，序列数据库将不断扩大范围，但目前非人类哺乳动物的序列信息相对还很少。目前所发表的信息中，大鼠的仅是人的一半，小鼠的更少。在细胞生物学中，主要问题是实验对象经常是非人类来源的细胞系或细胞器制备物，这将限制对蛋白质的鉴定。种属间肽质量信息的保守性很低，因为即使一个保守的氨基酸改变也将导致完全不同的肽质量。这意味单独的肽质量指纹谱在跨种属间鉴定常常是无效的。然而，可放宽查寻参数，如Peptidesearch 能成功的进行同源查寻。其它程序也正在发展类似的技术。


　

灵敏度

关于生物质谱灵敏度的报道很多，但在不同的实验室灵敏度差别很大。然而，实际上灵敏度与高通量是相交换的。 只要有足够的时间，专项技能和耐心，可以鉴定非常微量的蛋白质。但是对于常规鉴定而言，样品量至少应达到１００fmol或１pmol或者更多，例如对翻译后修饰蛋白质的鉴定。通常这个量相当于一条清晰的考马斯亮兰染色条带或点的量，对于序列已经存在于ＮＲＤＢ或ＥＳＴ数据库中的蛋白的快速鉴定非常有利。质谱可以分析更微量的样品（虽然不很容易），但对于含量低于fmol（很弱的银染程度）的样品，非常费力，目前还没有几个质谱实验室具备这种能力，即使有也不能保证。实际工作中，许多质谱实验室发现灵敏度被限制是由于化学噪音和（或）污染造成的,尤其是角蛋白或ＩgG。实际上经验丰富的人员一眼就能识别来源于不同种系角蛋白的肽段。角蛋白污染的来源是一个热门话题,但是看起来许多实验室被严重迎新，所以加强防护是必须的. 同时许多试剂如SDS-PAGE的聚丙烯酰胺可能在较低水平上被污染，而且污染程度因批次而不同。



　

具体示例

蛋白质复合物的鉴定：酵母p24蛋白复合物

最近，应用生化和基因方法从酵母、哺乳动物和青蛙中鉴定了一个保守的I型跨膜蛋白家族，称为p24蛋白家族，分子量23~27KDa。目前这些蛋白的功能尚不知道，但从几个证据可清楚地看出这些蛋白在细胞早期的分泌过程中起着非常重要的作用（1, 4, 6, 7, 8, 12, 33, 34, 37, 38,40）。通过观察酵母无效突变中载物特异性转运(Cargo specific transport)的延迟，结合p24蛋白I型拓扑结构和小泡包被蛋白在体外与胞质尾区的结合，可说明p24家族蛋白成员在细胞早期的分泌过程中可能作为载物的受体或载体而发挥作用（1, 34, 38）。



　



图2 Erp1p免疫沉淀蛋白质的鉴定 （A）从全细胞提取液中通过免疫沉淀获得Erp1p，沉淀物通过12%胶的SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用胶体考马斯蓝染色。图中，大约48Kd的条带对应于用来沉淀Erp1p的抗体重链。（B）对（A）中得到的条带进行MALDI-TOF MS分析。在质量准确度为± 0.1Da时，与Erp1p、Erp25p或Emp24p序列匹配的肽质量的位置用粗线标出。（C）C带的MALDI-TOF MS 质谱图 Erv25p的肽质量用兰色表示， Emp24p 的用红色表示，胰蛋白酶的用绿色表示。（D）带两个电荷，m/z为 687.3前体离子的纳升电喷雾MS/MS质谱图。 肽段分子量为1372.6Da，与从序列AIELDIESGAEAR预测的碎片离子相一致的肽段列于表中。从Erp25p中产生的序列用斜体在（B）中表示。



　

在啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，以前已鉴定了由Emp24 和 Erv25p基因编码的p24蛋白家族的两个成员（1, 34）。从内质网（ER）膜获得的复合物中，Emp24p 和 Erv25p相互作用（1）。另外，Emp24 和 Erv25p都是COPII包被小泡的主要蛋白。还有，Emp24 和 Erv25p的稳定性和与COPII包被小泡的掺入也是相互依靠的（1）。最近我们鉴定了S. Cerevisiae 中p24家族蛋白的另外6个成员（22）。因为该生物体的基因组已全部测序，这是对p24蛋白在真核细胞中第一次深入的研究。 缺失这些基因中被称为ERP1和ERP2的两个基因得到类似于缺失EMP24和ERV25的表型。基因和生化实验表明Emp24, Erv25p, Erv1p及Erv2p 以异型多聚复合物的形式共同起作用。在此我们报道用多克隆抗体免疫沉淀并鉴定该蛋白复合物成员Erv1p以及用质谱鉴定共沉淀蛋白质的研究。

为免疫沉淀Erp1p蛋白复合物，如文献（22）所述，在玻璃珠存在的情况下，将100OD单位的细胞裂解。裂解物用蛋白Ａ－Sepharose 予沉淀（消除本底），然后用５m l经亲和层析纯化的抗Erp１p抗体和蛋白Ａ－Sepharose 珠免疫沉淀过夜。免疫复合物经离心收集，然后用ＴＮＥＴ缓冲液（100mM Tris-HCI, pH8.0, 100mM NaCI, 5 mM EDTA, 1% Triton X-100）洗涤三次, 再用ＴＮＥ缓冲液（除Triton X-100外同TNET 缓冲液）洗涤一次，最后用20m l　２´ SDS加样缓冲液溶解，进行12%胶的SDS-PAGE，用胶体考马斯蓝染色（图２Ａ）。观察到三个主要的带，将它们从胶上切下，还原并烷基化，然后进行胶上的胰蛋白酶酶解，用质谱分析胰酶酶解肽段。

由MALDI-TOF MS测得的肽质量指纹谱的结果总结在图２B中。为说明清楚，将Ｃ带的MALDI-TOF MS图如图２Ｃ所示，以后将进一步讨论。Ｃ带酶解得到的肽段经MALDI-TOF MS分析的肽质量在100ppm质量准确度的范围内用PepSea 查寻软件检索一个蛋白质理论酶解序列数据库（见表１）。第一轮分析鉴定的七个肽段与Emp24p匹配（50% 的覆盖率）（见图2B 2C）。未匹配的肽段经第二轮分析鉴定为Erv25p酶解肽段（九个肽段，51%覆盖率）。四个胰蛋白酶自切肽段的也被鉴定。为进一步证实Emp24 和 Erv25p存在于C带，用nano-ESI-MS/MS对母离子进行裂解和测序分析。分析结果清楚地表明Emp24 和 Erv25p都在C带中。例如，图２D为一个母离子为687.3Da 的MS/MS谱。对该图的分析表明Erv25p中存在序列AIELDIESGAEAR（图２B）。

综上所述，这些分析清楚地鉴定了Erp1p免疫沉淀物中的Erp1p、 Erv25p及Emp24。通过LC-MS/MS对A带和B带的进一步详细分析不但确证了Erp1p的存在（数据未列出），而且检测到了两个不与Erp1p匹配而与Erp４p的肽段（肽段YTFCLSNNYGTSPK和NMYTVSSTESR）和一个有可能从Erp2p或Erp４p衍生的肽段（KVEITLEK）。基因数据表明编码p24蛋白质的ERP2和ERP4基因在功能上是多余的，但提示在体内是Erp2蛋白起作用（22）。虽然该分析不能认为是定量分析，但鉴定为Erp4p而不是Erp2p有点出乎人们预料。弄清Erp2p 和Erp4p各自在体内对p24蛋白功能的贡献还需要进一步的分析。和基因证据一起考虑（22），这些数据说明p24蛋白质通过一个或多个异型多聚体复合物而起作用。酵母p24蛋白和其它物种p24蛋白序列的相似性提示在真核细胞中p24蛋白的功能可能和p24蛋白复合物的保守性质有关。