液相色谱基本概念和术语

省部重点实验室

2012/05/13

私聊

液相色谱（LC）

一、基本概念和术语

1．色谱图和峰参数

Ø色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。

Ø基线(base line)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。

Ø噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

Ø漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

Ø色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。

Ø拖尾因子(tailing factor，T)——T＝，用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。

Ø峰底——基线上峰的起点至终点的距离。

Ø峰高(peak height，h)——峰的最高点至峰底的距离。

Ø峰宽(peak width，W)——峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ

Ø半峰宽(peak width at half-height，W_h/2)——峰高一半处的峰宽。W_h/2＝2.355σ

Ø标准偏差(standard deviation，σ)——正态分布曲线x＝±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。

Ø峰面积(peak area，A)——峰与峰底所包围的面积。A＝×σ×h＝2.507 σ h＝1.064 W_h_/2 h

2．定性参数（保留值）

Ø死时间(dead time，t₀)——不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

Ø死体积(dead volume，V₀)——由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，V_m）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有V_m参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V₀＝F×t₀（F为流速）

Ø保留时间(retention time，t_R)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。

Ø保留体积(retention volume，V_R)——从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。V_R＝F×t_R

Ø调整保留时间(adjusted retention time，t'_R)——扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'_R只决定于组分的性质，因此，t'_R（或t_R）可用于定性。t'_R＝t_R－t₀

Ø调整保留体积(adjusted retention volume，V'_R)——扣除死体积后的保留体积。V'_R＝V_R－V₀或V'_R＝F×t'_R

3．柱效参数

Ø理论塔板数(theoretical plate number，N)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。

N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：

N＝()²＝16()²＝5.54()²

N为常量时，W随t_R成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。

用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。

N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）

若用调整保留时间(t'_R)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N_有效或N_eff)。

Ø理论塔板高度(theoretical plate height，H)——每单位柱长的方差。H＝。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算：H＝，H_有效＝。

4．相平衡参数

Ø分配系数(distribution coefficient，K)——在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。K＝。

分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数　（或称交换系数），凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。

在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（C_s、C_m很小）时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。

在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。

在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。

Ø容量因子(capacity factor，k)——化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。k＝。因此容量因子也称质量分配系数。

分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k＝＝＝K＝，t'_R＝k t₀。上式说明容量因子的物理意义：表示一个组分在固定相中停留的时间（t'_R）是不保留组分保留时间（t₀）的几倍。k＝0时，化合物全部存在于流动相中，在固定相中不保留，t'_R＝0；k越大，说明固定相对此组分的容量越大，出柱慢，保留时间越长。

容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积V_s、V_m无关；k除了与性质及温度有关外，还与V_s、V_m有关。由于t'_R、t₀较V_s、V_m易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。

Ø选择性因子(selectivity factor，α)——相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α＝＝（设k₂＞k₁）。因k＝t'_R/t₀，则α＝，所以α又称为相对保留时间（《美国药典》）。

要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。

5．分离参数

Ø分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R＝。当W₁＝W₂时，R＝。当R＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定R应大于1.5。

Ø基本分离方程——分离度与三个色谱基本参数有如下关系：

R＝××

其中称为柱效项，为柱选择性项，为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特性有关，后两项与色谱过程热力学因素有关。

从基本分离方程可看出，提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R＝0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变流动相的组成及pH值；b. 改变柱温；c. 改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k₂趋于0时，R也趋于0；k₂增大，R也增大。但k₂不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k₂在1~10范围内，最好为2~5，窄径柱可更小些。

分
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