【转】红外光谱在中药指纹图谱研究中的应用汇集帖

省部重点实验室

2012/06/24

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中药/天然药检测

红外光谱在中药指纹图谱中的应用一直不被人们所重视，原因有很多，但我觉得主要是由于传统观念认为红外光谱的专属性差而不足以起到鉴别真伪的作用。在这里我想谈一下现阶段的理论突破，希望能引起足够的重视。
中草药的发展历史是以中国药剂学独特的、内在的整体理论为基础的，它倡导的是药物的总体治疗效果。因此，研究药物的单一成分不足以判断药物的功效。像质谱和HPLC等现代分析手段已经大大促进了中药鉴定和区分药物有效成分的能力。然而这些技术的应用往往只着眼于特定化学成分的研究，因此违背了将存在相互作用的多种成分混合在一起来分析的整体观念。
20世纪80年代后期曾出现过红外光谱法鉴别中药的某些报道，但由于光谱总体解析知识的贫乏、思路上的保守和缺乏交叉学科的相互渗透，其进展并不显著。。20世纪90年代后期以来，出现了将红外光谱法与计算机辅助解析技术有机的结合应用于中药鉴定的若干报道。二维相关红外分析通过交叉计算获得高分辨的“指纹图谱”作为中药宏观质量判别的依据。虽然各种中草药常常都是由数以百计的成分所组成，但由于各自所含化合物的组成不同，各种化合物的比例也有差异，其红外指纹图谱就不可能相同。将红外光谱技术应用于中药的全面质量控制是一种思路上的创新。

今后我将就红外光谱在中药（包括药材和制剂）指纹图谱研究中的应用作更多的论述，希望大家能踊跃交流。

红外指纹图谱反映的是中药整体质量信息，体现了中药作用的整体性和模糊性。
由清华大学化学系分析中心孙素琴副教授等所承担的国家中医药管理局中医药科技重大项目"中药材光谱法快速检测系统的研究"，于2月9日在北京通过了由国家中医药管理局组织的专家组验收。
　　该课题组首次将经典的红外光谱法进行了深层次拓展，创建了中药红外宏观指纹方法，并对野生与栽培、不同产地、不同生境、不同药用部位及不同等级的白芷和丹参药材的735个样品直接进行了分析测试。实验结果表明，在相对保证药材的真实性、道地性和代表性的前提下，凭借红外光谱法的可重复性和可靠性等特点，采用对各种中药材不经分离提取而直接进行检定，并以强有力的计算机辅助解析技术和模式别系统，对来自不同产区的栽培白芷样品的近红外谱图和中红外谱图进行模式识别系统分析研究，达到了分类识别的目的，且识别率达到了90％。同时对来自六省的栽培丹参样品和3省的野生样品进行模式识别系统研究，同样达到了分类识别的目的，对野生与栽培的丹参样品识别率也达到了90％。此外，该课题组还对280种中药材、400多种中药配方颗粒以及20种中药注射剂进行了较为深入的系统研究和分析，大量的实验数据证明，每一味中药，正如每个人都有指纹而且指纹各不相同一样，即具有一定的相似性，又显示出自身的特性。借助与计算机和模式识别技术，可以将中药的特性描绘出来，使每味中药都拥有如人的指纹一样的标准图谱。根据这些标准谱图，可鉴别药材的道地性、生长环境；并可针对不同生产批次和不同生产厂家的同一产品在物质组成上的差异性评价其真伪优劣，从而非常直观地进行鉴定、鉴别与质量控制。
　　专家们一致认为：该课题组经过攻关所建立的无需对中药进行提取分离等繁杂的化学处理而直接进行红外光谱分析检测的方法是目前中药材及其制剂最直接、快速、准确的鉴定鉴别和质量控制方法。该方法强调中药的整体性，不丧失其原本性、配伍性，符合中药中医辩证施治原则，以综合的、宏观的、非线性的分析理念和质量控制模式来评价中药的真伪优劣，以一定的量化指标（辅料的添加量或中药的特征峰峰强比）评价中药产品的稳定性和一致性，基本解决了质量标准化的问题。在现代中药宏观质量（整体）控制技术上取得了重大突破，为中药内在质量的宏观可控建立了一个适用性很强的监控方法。
浙江大学的程翼宇教授也做了相关的研究

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第1楼2012/06/24

续前：二维相关红外分析的基本原理
多谢大家参加讨论，今天论述一下二维相关红外分析的基本原理：不同的有机官能团在红外光谱中有各自特征的吸收峰，特别在低波数（通常为1300~900波数）有高度特征的指纹区。通过红外光谱的解析，就可以判定未知样品存在哪些官能团，并为最终确定化合物的结构奠定了基础。因此，红外吸收（发射）光谱是表征物质化学组成，研究其在分子层次上的结构及分子间相互作用的有力手段。鉴于常规红外光谱分析的原理及其导数技术已经为大多数人熟知，下面我将主要介绍二维相关红外光谱的原理。
在传统的光谱分析方法中，光谱图通常都是二维平面图形。其中，横坐标代表一个物理参量，如波长、波数等，纵坐标代表相对应的体系性质，如发光强度、吸光度、透光率等。但在实际研究的体系中，影响体系光谱学性质的变量通常不只一个。当多个因素同时作用于体系，或是若干个因素之间互有相关时，平面的二维光谱分析方法就无法反映出这些影响因素彼此之间的联系。为了解决上述的问题，引入三维光谱分析的概念。三维光谱图形具有两个独立的自变量轴，分别代表影响体系光谱学性质的因素，一个因变量轴，代表体系的某种光谱学性质，由此构成三维立体图形。从三维立体图中，可以清晰地看出体系地光谱学性质分别随着两个变量变化地情况和两个变量之间的相关性。
三维光谱大体上可以分为两大类，即相关光谱和非相关光谱。它们的本质区别在于是否将数学中的交叉—相关分析方法运用到光谱数据的处理中。在三维非相关光谱中，自变量通常是两个不同的变量（如时间分辨光谱中的时间和频率，三维荧光光谱中的激发波长和发射波长等）。这种三维光谱可以看成是一种“堆积谱”，图谱上的因变量维（强度）代表在相应的两个条件下，体系的某种光谱学性质的强度，具有实实在在的物理意义。而三维相关光谱则不然，它的核心思想在于对体系的动态光谱数据进行交叉－相关分析，从而得到一系列非常有用的二维相关谱图。谱图的两个变量通常是一个物理量，彼此之间是相关的。谱图上的第三维－因变量维可以当作是一种广义上的光谱强度。国际上通常将三维相关谱图统称为二维相关谱。这是因为在实际应用中，三维相关谱图中的相关峰的峰位置显得尤为重要，而峰强度一般只是用来表征相关峰的相关性的强弱。这种二维相关谱有两种表示方法。一种是将相关强度和两个频率变量都包括在内的三维立体谱图，称为渔网图，另一种是按不同相关强度切割出来的，只包括两个频率变量的等高线图。

红外光谱应用于中药指纹图谱的特点如下：

第一，指纹性，红外光谱的指纹性早已成为共识。纯化合物的分子振动光谱反映了分子内部存在的各种基团具有指纹特性的振动。对于一个混合物体系，其分子振动光谱的峰形、峰位、峰强代表着体系中所含各种相应基团的谱峰的叠加。混合物组成的变化，将直接导致分子振动光谱整体谱图的变化，但仍能保持其谱图的宏观指纹性。利用这种宏观指纹性，就可以直接地或者稍作数学处理后，用于中药鉴定与质量控制。

第二，对被测试样的状态无特殊要求，气态、液态与固态皆可。因此在大多数情况下，对试样的测定可以做到不失原本性，无损性。

第三，简便、快捷，对试样只作物理粉碎压片等简单处理，无需经过繁琐的分离提取过程就可以直接测试。

第四，仪器较为通用，测定操作简便，易于推广应用。

第五，对中药进行全组分测定，获取的是全貌整体信息。因此不破坏配伍性。

第六，可以利用公认的，药效稳定的药材、成药直接进行标准化，不必专门寻求单个的，纯的标准物。

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第2楼2012/06/24

大家讨论好像不够热烈呀，没关系，我继续介绍中药二维相关红外光谱指纹图谱的实验方法：

第一，样品的来源：
应该从中国药品生物制品检定所购买对照药材，以制备药材的标准图谱。在采集不同产地药材进行鉴定比较。

第二，固体样品的制备：
首先将药材样品研磨成粉末。由于药材硬度比较大，不易研磨，可采用液氮冷却法（将药材剪切成小碎块，放入研钵中，加入液氮，迅速研磨。反复多次即可），这样可以保证样品的成分不挥发。药材粉末的粒度一般应控制在200目以下，压片时取1～2mg即可，然后加入约200mg的KBr粉末，在研钵中研磨、混匀，转移到模具中，在低真空下用9.81GPa左右的压力，一般经过2min～5min即可将样品压成透明的薄片。压片的厚度约为1mm～2mm。注意：压片法所用的KBr必须很纯，应采用分析纯的或者KBr碎状晶体（最佳）；KBr易吸水，KBr粉末必须进行干燥处理，一般要在120℃烘烤4小时以上；KBr粉末的粒度应控制在200目～300目之间。压片法可以保证谱图的质量及谱图的指纹性，易于推广应用。

第三，液体样品的制备：
在中药分析中常常会碰到大量的液体样品，如中药注射剂、汤剂等，可采用一些红外附件技术，如衰减全反射附件；对某些粘稠样品，可采用镜面反射附件等。但由于这些附件技术能量损失比较大，谱图的信噪比差，会直接影响谱图的质量。另外，样品中的溶剂水也会影响谱图的质量，影响谱图的分析（因为水有非常强的吸收）。因此，若要测定液态中药的标准谱图，最好还是采用经典的压片技术比较可靠，但事先必须除去溶剂水。常用的方法是采用冷冻干燥法，即先将液体样品冷冻后，在抽真空下脱水。然后将冷冻干燥后的粉末样品压片测定。

好了，今天先到此为止，样品制备技术是指纹图谱测定的关键技术之一，希望我的论述对大家有所帮助。

续上：

第四，光谱测定：
实验采用傅立叶变换红外光谱仪，光谱范围400cm-1~4000cm-1、DTGS检测器，分辨率4cm-1，扫描次数16次，扫描时实时扣除水和CO2的干扰。动态光谱的测定采用变温附件，样品于KBr粉末一起研磨压片，装在变温附件的样品架上测定光谱图。控温范围是室温至120℃，升温速度是2℃/min，每10℃采集一次光谱。

我想对于中药指纹图谱从以前的高效液相指纹图谱到红外光谱中药指纹图谱的提出是一个很令人佩服的事，这样的想法，因为省去了分离的过程，加上红外操作的简洁性，大大简化了中药指纹图谱的工作。但也有一些问题必须考虑

1 红外光谱中药指纹图谱的信息容量。大家知道在红外光谱的范围4000-400波数，1200以上为官能团特征吸收区，1200以下为指纹区（单一化合物在1200以下交叠严重）。我们可以考查一下，红外光谱中一个普通峰的半峰宽是多少，然后粗估一下在4000-400平均可以容纳有多少个峰（设为N），然后我们估想一下一个化合物平均会出现多少个峰分布在4000-400的范围（设为n），而中药中的成分设为m，最后的结果肯定是：N<
2 至于”像质谱和HPLC等现代分析手段已经大大促进了中药鉴定和区分药物有效成分的能力。然而这些技术的应用往往只着眼于特定化学成分的研究，因此违背了将存在相互作用的多种成分混合在一起来分析的整体观念。“的说法，我觉得有些误会。像质谱和HPLC等现代分析手段并不是只着眼于特定化学成分的研究，在HPLC-MSn 的分析中，最后得到的是一分包蕴一个中药系统大部分的整体的结果，我们不是将物质分开就只是仅仅看其中分离开的一个或几个物质，而是进行整体的分析。

另外，对于无名兄关于二维红外光谱”谱图的两个变量通常是一个物理量“，这通常是一个物理量不很理解，我对二维红外光谱不了解，单根拘二维核磁的知识，在二维核磁中两个自变量虽然都是频率，但是两个不同的物理量。谢谢。