【“特色”应用方法】LC-MS/MS法测定Beagle犬血浆内化合物X含量

LC-MS/MS法测定Beagle犬血浆内化合物X含量

实验背景

化合物X是某在研新药的主要成分，具有免疫、中枢神经等多方面药理活性，本文建立了化合物X在Beagle犬血浆内的LC-MS/MS检测方法学，通过固相萃取操作，除去了绝大部分血浆杂质干扰并最大程度减小了基质效应。通过同时检测化合物X的两个子离子，排除了血浆中化合物X的假阳性成分。结果显示本方法特异性好，灵敏度高，操作简便快速，为其药代动力学等后续研究奠定了基础。

检测条件

1. 仪器及试剂

TSQQuantum Access三重四极杆液质联用仪，美国Thermo Fisher公司；Milli-Q超纯水仪，美国ThermoFisher公司；离心浓缩仪，美国LABCONCO公司；Anke-16G离心机，上海安亭科学仪器厂；AW-120电子天平，日本岛津公司；固相萃取仪，Cleanert PEP 固相萃取柱（30mg每支装），天津博纳艾杰尔科技有限公司。甲醇为色谱纯，由Tedia公司提供；水为实验室Milli-Q超纯水仪自制。

2. 色谱质谱条件

色谱条件：色谱柱：Thermo BDS HYPERSIL C18柱（2.1mm×150 mm，5 mm）；柱温：40℃；流动相：甲醇：醋酸铵缓冲液（10mmol/L，pH=5）=70：30（v：v），流速：0.2mL/min；进样量：10 μL；质谱检测器。

质谱条件：正离子方式检测，Spray Voltage：3500 V，SheathGas Pressure：35，IonSweep Gas Pressure：0.0，AuxGas Pressure：5，CapillaryTemperature：300 ℃，TubeLenz Offset：128，SkimmerOffset：0，CollisionPressure：1.0，CollisionEnergy：化合物X：m/z[M+H]+：969.5→789.1，43 V，m/z[M+H]+：969.5→348.6，50 V（图1），内标：m/z[M+H]+：180.0→110.1，20 V（图2）；扫描方式：化合物X和内标非那西丁均采用选择反应监测模式（SRM），用于定量的离子分别为m/z[M+H]+：969.5→789.1与180.0→110.1；化合物X同时监测子离子m/z[M+H]+：969.5→348.6，用于排除实际样品的假阳性现象（实际样品中含有m/z[M+H]+：969.5→789.1的假阳性成分，出峰时间为9.60 min）。

图1 化合物X的质谱裂解图（MSMS模式）

图2 内标非那西丁的质谱裂解图（MSMS模式）

实验过程

1. 对照品溶液配制及工作液稀释

称取化合物X对照品10.5 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成1.05mg/mL母液，临用前以甲醇稀释成各个浓度工作液；称取内标物非那西丁10.0 mg，置20 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成0.5 mg/mL母液，临用前以甲醇稀释成低浓度工作液。

2. 样品制备

480 μ犬空白血浆，加入工作液10 μL，内标10 μL，漩涡混匀后，制成各个浓度的血浆样品。

3. 样品样品处理

活化：PEP-SPE小柱以1 mL甲醇活化，并以1 mL水清洗，弃滤液，关闭固相萃取仪开关等待上样，注意整个过程中使液面保持在填料之上。

上样：0.5 mL犬血浆样品，加入0.5 mL醋酸铵缓冲液（10mmol/L，pH = 5），漩涡数秒使混匀，经13000rpm离心5 min后取上清液加至已活化PEP-SPE小柱，调节负压使达到约1 mL/min流速。

清洗：待上清液基本通过SPE小柱后，再以1 mL水清洗小柱，弃滤液，待清洗液将流尽时可增加负压除尽滤液。

洗脱：除尽滤液后，加入1 mL甲醇洗脱，收集洗脱液。

浓缩复溶：洗脱液置于离心浓缩仪内挥干溶剂。用200 μL流动相溶解，漩涡震荡2 min，13000rpm离心5 min，离心两次，取上清液进质谱仪分析。

4. 考察项

分析方法参考“化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则”关于生物样品分析方法验证的要求，并通过特异性、线性、准确度、精密度、回收率等指标验证。

结果

1. 方法选择性

取6只Beagle犬（雌雄各半）的空白血浆各0.48 mL，加入甲醇20 μL，除不加工作液及内标外，其余按“样品处理”项操作，在本实验色谱条件下进样10 μL，进行LC-MS/MS分析，获得空白血浆色谱图3-A。另在空白血浆中加入将一定浓度的化合物X及内标溶液，同法操作，获得相应的色谱图3-B，化合物X与内标物质的保留时间分别为2.17与2.39 min。结果表明，在本试验条件下，空白血浆中的内源性杂质不干扰样品测定。但实际样品中含有m/z[M+H]⁺：969.5→789.1的假阳性成分，出峰时间为9.60min，且峰型巨大（图4），因此同时监测子离子m/z[M+H]⁺：969.5→348.6，实际样品的假阳性成分对于离子m/z[M+H]⁺：969.5→348.6并无响应，可以确认该成分并非为目标化合物X。由图可知，犬血浆样品中内源性杂质不干扰化合物X和内标的测定，且本方法可排除假阳性成分干扰，方法选择性好。

图3 化合物X选择性考察色谱图

（A：空白犬血浆色谱图；B：空白犬血浆加入化合物及内标后的色谱图。每张图谱中自上而下分别为总离子流图、内标m/z[M+H]⁺：180.0→110.1碎片离子色谱图、化合物X m/z[M+H]⁺：969.5→348.6与m/z[M+H]⁺：969.5→789.1的碎片离子色谱图）

图4 实际样品假阳性结果，保留时间为9.60min

（A：质控样品色谱图；B：实际样品色谱图。每张图谱中自上而下分别为总离子流图、内标m/z[M+H]⁺：180.0→110.1碎片离子色谱图、化合物X m/z[M+H]⁺：969.5→348.6与m/z[M+H]⁺：969.5→789.1的碎片离子色谱图）

2. 标准曲线及定量下限

Beagle犬空白血浆0.48 mL中，分别加入不同浓度化合物X工作液及内标工作液各10 μL，配制成相当于化合物X 2～1000 ng/mL范围内各个浓度的血浆样品，按“样品处理”项操作，标准曲线考察各浓度点3样本分析，定量下限考察6样本分析。以化合物X浓度为横坐标，化合物X与内标物的峰面积比值为纵坐标回归运算，得化合物X 2～1000 ng/mL的标准曲线。标准曲线的相关系数r均大于0.99。

3. 回收率试验

取Beagle犬空白血浆0.48 mL，依次加入不同浓度化合物X工作液以及内标溶液各10 μL，配制成相当于化合物X 5，200，800 ng/mL的血浆样品，按“样品处理”项操作，每一浓度6样本分析。另取空白血浆0.48 mL，加入甲醇20 μL，制得对照样品，按“样品处理”项操作，在制得的对照样品上清液中加入相应浓度的对照品工作液。血浆样品峰面积与对照样品峰面积比值即为绝对回收率。结果血浆中化合物X的绝对回收率为86.9%～95.7%。

回收率试验曾对比博纳艾杰尔公司的C18-SPE小柱、PEP-SPE小柱及其他公司阳离子交换小柱进行对比考察，发现Cleanert PEP 固相萃取柱回收率最高（均值大于75%）。后又对Cleanert PEP 固相萃取柱不同装量的回收率进行对比，发现30 mg每支装量即可满足本方法的回收率要求，装量提高对于回收率提高影响不大，综合考虑回收率结果及经济成本后选定安杰尔公司30 mg每支装量的Cleanert PEP 固相萃取柱作为本试验固相萃取用。

4. 准确度与精密度试验

取Beagle犬空白血浆0.48 mL，依次加入不同浓度化合物X工作液以及内标溶液各10 μL，配制成相当于化合物X 5，200，800 ng/mL的血浆样品，按“样品处理”项操作，每一浓度6样本分析，用待测物/内标峰面积之比，代入当日标准曲线，计算得到相应的浓度。测得浓度与理论浓度之比，即为化合物X的方法回收率。本段前述内容不同天内依法平行操作3次，考察批内及批间变异情况。结果方法回收率为95.6%～111.3%；批内变异系数小于13.6%，批间变异系数小于8.9%。

结论

经过对Beagle犬血浆内化合物X方法学验证，结果选择性好，回收率高，灵敏度高，操作简便快速，各项指标均符合要求，并已初步应用于药动学研究，说明本方法准确可靠，可用于后续药动学研究。