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细菌总数测定法

省部重点实验室

2013/06/16

生命科学仪器综合讨论

细菌总数测定法
一、设备和材料
恒温培养箱、恒温水浴槽、试管、移液管、菌落计数器、放大镜、托盘天平、称量纸、培养皿。
二、培养基和试剂
营养琼脂培养基 0.9%生理盐水
三、检验程序
待检样适当倍数的稀释液选择2-3 个适当稀释度各1ml分别加入灭菌平皿内每皿内加入适量营养琼脂 37℃ 48±2小时菌落计数→报告
四、操作步骤
1．按无菌操作要求称取样品10g，连同100ml生理盐水加入灭菌三角瓶内，震荡，使成1∶10的均匀供试液。
2．用1ml 灭菌吸管吸取1∶10的供试液 1ml，在离稀释剂液面上约1cm处，沿管壁注入装有9ml 灭菌的盐水管中，混匀即为1∶100的稀释液。
3．另取1ml 灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释。如此每递增稀释一次，应换用一支1ml灭菌吸管并充分混匀，稀释至10-3 倍数或适当倍数备检。
4．在做上述10倍递增稀释时，每稀释妥一稀释度，即可取1ml稀释液注入9厘米平皿内。（一般可根据对供试品污染情况的估计，从供试液起，选择2-3个适宜稀释度进行测定，每个稀释度各用2-3个平皿）
注：每次吸液时均应将待稀释液充分混匀，充分振荡或用吸管反复吹系数次。
4．稀释液注入平皿后，将熔化并冷至45～50℃的肉汤琼脂培养基倾注平皿内约15mL，转动平皿使充分混合均匀后置水平台待凝。
5．琼脂凝固后，翻转平板，置30-35℃培养箱内培养24h、48h，分别计算平板内生长的菌落，以48小时的菌落数为准。
五、菌落计数方法
先用肉眼观察，点数菌落数（霉菌不包括在内），然后持放大镜检查有无遗漏，各平板菌落计数后，求出同一稀释度各平板生长的平均菌落数，如平板中有连成片状的菌落或在点样菌落蔓延生长时，该平板不宜计数。
六、细菌菌数报告
一般的报告方法是选取同一稀释度平均菌落数在30～300个之间的平板，作为菌落总数测定的范围，其中一个平板有较大片状菌落生长时，或两平板菌落数相差一倍以上，此稀释度不宜采用，稀释度的选择：
1．一个稀释度，平均菌落数在30～300个之间时，乘以稀释倍数报告。
2．两个稀释度，平均菌落数在30～300个之间，则应求出两者总菌数之比，比值小于或等于2应报告平均数，大于2则报告其中较小的数字。
3．有稀释度的平均菌落数均多于300个，应按稀释度最高的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。
4．所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则按稀释倍数最低的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。
5．所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一个稀释度大于300，而相邻的另一稀释度小于30，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
6．有稀释度均无菌生长，报告数为<10个/克。
菌数的报告，菌数在100以内时，按实有数报告之，大于100时，采用左端前2位数字，在前两位数字之后的数值，以四舍五入法计算，数字后面的空，可用10的指数表示。
如供试品经检验细菌数不符合要求，无特殊规定时应重新取样，依法复检两次，按三次结果平均值报告并判定合格与否。

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