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分离/萃取
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石蜡切片、冰冻切片及振动切片的区别
wpic888
2013/12/17
私聊
分离/萃取
一
、
石蜡切片
把修好的蜡
块
装在旋
转
切片机上,即可
进
行切片(section)。切片必
须
保持切片刀
锐
利,切片厚度通常
为
5~7um,也可根据染色需要切成不同厚度,一般不旋
转
式切片机超
过
10um。切好的蜡
带
,放人40
℃
左右的温水中将蜡片展平。良好的切片
应
无刀痕、裂痕,切片厚度均一平整。切片如有上述
问题
,在
进
行免疫
组织
化学染色
时
会出
现
假阳性
现
象。
为
能得到平整无
皱
褶的
组织
切片。可采用两次展片,即先将
组织
切片漂浮在30%的乙醇溶液中
进
行第一次展片,然后将切片
捞
起,再次放人45~50
℃
的水浴中
进
行第二次展片,乙醇的
浓
度和水温可
视组织
不同和石蜡熔点的高低自行
调
整。此
过
程是利用乙醇溶液与水之
间
的
张
力差展开切片的
皱
褶。
为
防止脱片,
载
玻片要涂黏片
剂
。
对
HE染色的切片,可在
载
玻片上涂抹薄
层
蛋白甘油,但蛋白甘油因含蛋白易
导
致非特异性免疫反
应
,故用于免疫
组织
化学染色的切片常用多聚
赖
氨酸、3—氨丙基—乙氧基甲硅
烷
等
处
理。
二、
冰
冻
切片
冰
冻
切片(fiozen section)是
酶组织
化学和免疫
组织
化学染色中最常用的一种切片方法,其最突出的
优
点是能
够较
完好地保存
细
胞膜表面和
细
胞内多种
酶
活性以及抗原的免疫活性,尤其是
细
胞表面抗原更
应
采用冰
冻
切片。新
鲜组织
和已固定的
组织
均可作冰
冻
切片。
为
了得到高
质
量的冰
冻
切片,
选择
好的冰
冻
切片机
和配套的
一次性刀架
是保
证
切片
质
量的关
键
。
组织
在切片前需要冰
冻
,而冰
冻过
程容易使
组织
中的水分形成冰晶,从而影响抗原定位。一般
认为
,冰晶体
积
大而量少
时
,影响
较
小;冰晶体
积
小而量多
时
,
对组织结
构
损
害
较
大。含水量
较
多的
组织
中
较
易出
现
冰晶。
1.防止
组织
中冰晶形成的方法
(1)速
冻
:使
组织
温度
骤
降,减少冰晶的形成。方法包括:
1)干冰—丙
酮
(乙醇)法:将150~200ml丙
酮
(无水乙醇)装入小保温杯内,逐
渐
加入干冰,直至
饱
和呈黏稠状,再加干冰不再冒泡
时
,温度可达-70
℃
,用一小
烧
杯内装异戊
烷约
50ml,将此
烧
杯
缓
慢置人干冰—丙
酮
(或无水乙醇)
饱
和液内,至异戊
烷
温度-70
℃
时
即可使用。将
组织
(大小
为
lcm×0.8cm×0,5cm)投入异戊
烷
内速
冻
30~60秒后取出,置恒冷箱内以
备
切片,或置-80
℃
低温冰箱内
贮
存。
2)液氮法:将
组织块
平放于
软
塑瓶盖或特制
锡纸
小盒(直径
约
2cm),可适量加OCT包埋
剂
浸没
组织
,然后将特制小盒
缓缓
平放人盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮
时
即开始汽化沸
腾
,此
时
小盒保持原位,切勿浸入液氮中,大
约
10~20秒后
组织
即迅速冰
结
成
块
。取出冷
冻
的
组织块
立即置人恒冷箱切片机冷
冻
切片或置人-80
℃
冰箱
贮
存
备
用。
(2)
应
用蔗糖溶液:将
组织
置于20%~30%蔗糖溶液l~3天,利用高渗吸收
组织
中水分,减少
组织
含水量,可防止或减少冰晶的形成。
2.恒冷箱切片法
冷
冻
后的
组织块
即可用于恒冷箱切片,其
过
程包括以下步
骤
:
(1)
组织
包埋根据研究目的取所需
组织
(如切取小鼠肝
脏
1.0cm×l.0cm×0.5cm大小的
组织块
),用
滤纸
吸去多余水分,将
组织块
平放于用特制
锡纸
小盒(直径
约
2cm)或
软
塑瓶盖内。加适量OCT包埋
剂
浸没
组织
,40
℃
浸透20—30分
钟
。
为
防止冰晶形成,包埋前可
进
行蔗糖
处
理。
(2)
组织
冷
冻
:按上述干冰—丙
酮
(乙醇)法或液氮法冷
冻组织
。
(3)切片:切片前1小
时
将恒冷箱切片机的温度
设
定
为
-18
℃
左右,以
备
切片。切片
时
温度以-15—-18
℃
为
宜,温度
过
低
组织
易破碎。刀的角度要适当?否
则
不易
连
片。用
载
玻片
贴
附
组织
切片
时
,勿上下移
动
。未
经
固定的新
鲜组织
在冰
冻
切片后
应
使用相
应
的固定
剂
固定10分
钟
。冰
冻
切片后如不立即染色,必
须
用
电风
扇吹干,
贮
存于-70
℃
低温冰箱内或
进
行短
暂预
固定后低温冰箱保存。染色前从冰箱内取出切片,置室温干燥10分
钟
,再
经
冷丙
酮
固定5~10分
钟
(未固定者),PBS漂洗3次后即可
进
入染色程序(HE染色可用甲
醛
、冰醋酸和95%乙醇快速固定1—2分
钟
)。
(4)冰
冻
切片的保存:冰
冻
切片后如不能及
时
染色,可在干燥后装入密封的
标
本盒内,外包塑料袋,
贮
存于低温冰箱,或
进
行短
暂预
固定后于低温冰箱保存。
三、
振
动
切片
用
振
动
切片机
(vibratome)可以把新
鲜组织
(不固定、不冷
冻
)切成20~400pm的厚片,以漂浮法在反
应
板内
进
行
组织
化学或免疫
组织
化学染色。因
组织
不冷
冻
,无冰晶形成也无
组织
抗原破坏,染色前又避免了
组织
脱水、透明、包埋等步
骤对
抗原的
损
害,故能
较
好地保留
组织
内脂溶性物
质
和
细
胞膜抗原。
振
动
切片
主要用于
显
示神
经
系
统
抗原分布的研究。
对
于柔
软
的胚胎
脑组织
,可用低熔点(45—55
℃
)10%
琼
脂糖包埋,振
动
切片机切成厚片(40—100gm),采用漂浮法在反
应
板内
进
行免疫
荧
光
组织
化学染色,激光
扫
描共聚焦
显
微
镜观
察。
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千层峰
第1楼
2013/12/17
请不在发隐藏链接。。。
0
发表回复
+关注
私聊
透明
第2楼
2013/12/29
下次再发隐形链接就删你帖子了
0
发表回复
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