仪器信息网APP
选仪器、听讲座、看资讯
立即体验
APP内打开
回版面
评论
收藏
点赞
拍砖
举报
取消
发布
当前位置:
仪器社区
>
生命科学仪器
>
生命科学仪器综合讨论
>
帖子详情
双酶切连接反应之全攻略
省部重点实验室
2014/01/07
私聊
生命科学仪器综合讨论
前一阵子一直在做双酶切质粒重组,失败了 很多次,不过很快改善了 实验方法,用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会,结合丁香园战友的宝贵经验,谈一下质粒重组的一些个人经验。
1. 回收PCR产物
在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来,限制酶的 选择非常重要,尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶,如BamHI、HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后,在各个酶的两边加上保护碱基,其原则可参照:http://img.dxy.cn/upload/2006/08/13/31219184.pdf。
双酶切时间及其体系:需要强调的是很多人建议酶切过夜,其实完全没有必要,我一般酶切3个小时,其实1个小时已经足够。应用大体系,如100微升。
纯化问题:纯化PCR产物割胶还是柱式,我推荐柱式,因为割胶手法不准,很容易割下大块的胶,影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物,既然如此,酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以,PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒。
酶量的问题:以TAKARA的为例,其对1单位酶的定义如下:在50 μl 反应液中,30℃温度下反应1小时,将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升,在除外酶降解的 因素外,该酶可分解15 μg的DNA,而一般从1-4 ml菌液提出的 DNA约为3 μg,而PCR纯化后的产物(50体系)约为3 μg,所以即便全部加进去,只要纯化的 质量好,酶切完全切得动。
2. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接
摩尔比的计算,很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段:回收的PCR产物片段=1:10 ,一般取前者0.03 pmol,后者取0.3 pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA:(X pmoles×长度bp×650)/ 1,000,000 (注:长度bp×650是该双链DNA的分子量)所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1 pmol 1000 bp DNA=0.66 μg,如载体是5380 bp,则0.03 pmol为
0.03×5.38×0.66=0.106524 μg。
测DNA浓度可以在专用机子上测,注意OD值,一般约1.8-2.0,另外,如果嫌麻烦,也可用MARKER进行估测,如MARKER2000,5微升的 MARKER每个条带约50 ng。
连接反应:TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜,而其对连接酶单位的定义为:在20 μl的连接反应体系中,6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时,有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。而它的浓度为350 U/μl ,所以完全够用。连接酶容易失活,注意低温操作,最好在冰上。时间3个小时足已。
3. 转化
a. 全量(10 μl)加入至100 μl JM109感受态细胞中,冰中放置30分钟。
b. 42℃加热45秒钟后,再在冰中放置1分钟。
c. 加入890 μl AMP阴性培养基,37℃振荡培养60分钟。
取100 μl铺板。也可离心后余100 μl。
几个非常重要的问题
1. 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解,为保险起见,一般连接3小时,16度。
2. 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里,烤箱一般温度为55-60度,然后做的时候拿出来,这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。
3. 对照的设立:
为验证双酶切是否成功,可做如下对照:
A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性,如两管均成线性可初步判断双酶切成功。
做转化时也要进行对照。
设4个:
A. 即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培养基、连接酶都'正常'的情况下。
B. 酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒。
C. 设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误。
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况。
4. 所有的试剂切记低温保存
一步一个脚印,不要偷懒,图省事最后却更费事,注意设立对照。
经PCR鉴定,克隆90%-100%的阳性率,所以在后面的 挑克隆中,我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定,测序。
分
该帖子已被
版主-zhang8826857
加2积分,加2经验;加分理由:鼓励分享
相关话题
1
五颜六色的采血管
2
人用肝素化采血管的质量控制
3
生气与疝气有关吗
4
硅胶假体-乳房植入物的安全性
5
肺癌概述及早期诊断
近期热榜
迎国庆送壕礼!十月发帖抢大疆云台
【官方邀请】高效液相色谱使用情况有奖调研
喜迎国庆!第十七届原创大赛超级原创日参赛奖励翻倍
丹纳赫四十周年寄语征集领大礼包
热门活动
【售后专场--招聘会】
第三届微课大赛投票进行中ing
猜你喜欢
最新推荐
热门推荐
更多推荐
细胞转染实验方法
讨论
2019/03/14
实验室常用微生物菌种的分离和纯化方法
分享
2012/04/28
【资料】流式细胞仪的应用-检测细胞凋亡
2007/05/17
50L液氮罐可以装多少细管
原创
2024/05/14
质粒房工作守则
分享
2013/06/16
【分享】谷氨酸发酵液除菌体提取谷氨酸研究进展
2010/11/08
【求助】酶比活性降低时,为什么蛋白质含量还那么高?
2007/12/12
【讨论】女生烫发是什么原理
2010/11/23
医疗仪器的革新:守护生命的科技力量
分享
2024/09/19
仪器的魅力:科技探索与精准控制的基石
分享
2024/09/19
Tigergene动物实验用颅钻
原创
2024/09/16
全光谱流式细胞仪原理,可以帮忙解答一下吗
原创
2024/09/09
bd流式细胞仪多少钱一台,可以帮忙解答一下吗
原创
2024/09/09
生物技术领域外商投资放开-干细胞重大利好!
原创
2024/09/09
化学发光免疫分析原理,能不能展开详细说说
原创
2024/09/07
Excounter第三代全自动外泌体分析仪重磅上市(让外泌体检测从此简单)
原创
2024/09/07
用实力证明 - 技术人员能力好坏“我说行就行”的时代过去了?
第十七届原创
2024/10/02
同一个部门的人进门还让登记,宝宝很生气!
第十七届原创
2024/10/03
气象色谱仪显示ALS 故障代码 153是什么情况
求助
2024/09/27
环境空气氮氧化物曲线斜率偏高怎么办
已应助
2024/09/27
出峰时间和分子离子峰一样,二级质谱图不一样是同种物质吗
求助
2024/09/28
玻璃器皿的质保期
求助
2024/09/28
关于CNAS-G001:2024里的条款理解?
求助
2024/09/30
岛津2014色谱TCD检测标气中的氧气和氮气,氧气不出峰怎么处理
求助
2024/09/29
如何使用DNAMAN软件制作序列比对图(发表论文用)
分享
2014/01/07
细胞计数实验中初学者易犯的错误
分享
2014/01/07
ESI负源 灵敏度下降为原来十分之一
已应助
2014/01/07
PCR扩增DNA特异性片段实验方法与步骤
分享
2014/01/07
荧光标记DNA探针在细胞核混悬液杂交中的应用
分享
2014/01/07
空气发生器的活性碳、硅胶购买时有什么特殊要求吗?
讨论
2014/01/07
大家交流一下认可实验室管理中的一些好习惯。
讨论
2014/01/07
新的一年中大家都有什么认证计划呢?
讨论
2014/01/07
品牌合作伙伴
丹纳赫苏州基地 打工人的梦想
岛津
日立科学仪器
珀金埃尔默仪器(上海)有限公司(PerkinElmer)
日本电子株式会社
丹纳赫
安捷伦
赛默飞世尔科技
普析通用
欧波同
天美
天瑞仪器
德国耶拿
海能技术
马尔文帕纳科
磐诺科技
上海仪电科仪
梅特勒托利多
聚光科技
莱伯泰科
盛瀚
多宁生物
丹东百特
科哲
卓立汉光
屹尧科技
华谱科仪
宝德仪器
优莱博
HORIBA
布鲁克核磁
举报帖子
执行举报
点赞用户
好友列表
加载中...
正在为您切换请稍后...