微生物保存——冷冻真空干燥保存法

2、材料

菌株

待保藏的各种菌种。

试剂

2% HCl；脱脂牛奶（20%乳液）、50%甘油。

器具

培养皿、5mlEP管、接种环、大三角瓶、高压蒸汽灭菌锅、牛皮纸、酒精灯、恒温培养箱、振荡培养箱、离心机、酒精棉球、安瓿管、标签、移液枪、普通棉、、冻干机。

培养基：LB液体培养基、LB固体平板培养基。



3、主要流程

备安瓿管→备脱脂乳→制菌悬液→分装→预冻→真空干燥→封管保藏

4、操作方法

4.1准备安瓿管

安瓿管先用2%HCl浸泡过夜，再用水洗多次，用蒸馏水冲洗三次，烘干。管口塞上棉花，用牛皮纸包扎，灭菌备用。 （121℃灭菌30min）

4.2制备脱脂乳

使用脱脂奶粉配兑脱脂牛奶，配成20%乳液，灭菌（112℃灭菌5min），并做无菌试验后备用。

4.3制菌悬液

①平板划线：将活化后的菌株用接种环进行平板划线，对菌种进行纯化。倒置37℃恒温培养过夜。

②增菌培养：挑取单个菌落接种于液体培养基（3ml左右）中，振荡培养。

③甘油保存：菌液：甘油=0.75:0.75ml的比例，对菌株进行甘油保存（2管）。

④离心：将EP管放入离心机中进行离心，去掉培养基。

⑤配菌悬液：将1ml无菌脱脂牛奶直接加到离心后的EP管内，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。 一般要求制成的菌液浓度达108~1010个为宜。

4.4分装

用移液枪将悬浮液分装入安瓿管底部，每支安瓿管的装量约为0.2毫升(需4管) 塞上棉花，并贴上标签。

4.5预冻

将分装好的安瓿管在冰箱冷冻室进行预冻。

4.6真空干燥

预冻以后，将安瓿管放入真空器中，开动真空泵进行干燥。（冻干机的使用方法）

4.7封管

封管前将安瓿管装入歧管；真空度抽至1.33Pa（0.01毫米汞拄）后，再用火焰熔封，封好后，要用高频火花器检查各安瓿管的真空情况。如果管内呈现灰蓝色光，证明保持着真空。检查时高频电火花器应射向安瓿管的上半部。

采用酒精喷灯，封管。

4.8保藏

做好的安瓿管应放置在低温避光处保藏。（4℃冰箱保藏）