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【生活中的仪器分析】不同检测器测定乳及乳制品中牛磺酸含量

  • bingwang228
    2014/05/14
  • 私聊

乳制品检测

  • 不同检测器测定乳及乳制品中牛磺酸含量

    牛磺酸是一种非蛋白结构的含硫氨基酸,在促进中枢神经系统生长发育、提高学习记忆能力及延缓衰老等方面具有重要调节作用,特别是对婴幼儿的生长发育起着重要的作用。目前,牛磺酸的测定方法主要有分光光度计法、薄层层析法、氨基酸自动分析法和高效液相色谱法。高效液相色谱不能直接对牛磺酸进行测定,需对牛磺酸进行衍生,常用的衍生试剂有:邻苯二甲醛、24-二硝基氟苯、异硫氰酸苯酯和丹磺酰氯等。丹磺酰氯是一种强荧光剂,可用于测定肽链的氨基末端,与肽的N-端氨基酸反应生成丹磺酰-肽,后者水解得到的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光。丹磺酰氯有多种优点:反应专一;荧光强烈;灵敏度比二硝基氟苯法高;丹磺酰-氨基酸不需提取等。本实验采用丹磺酰氯为衍生试剂,采用柱前衍生高效液相色谱法测定乳及乳制品中牛磺酸的含量,并用二极管阵列和荧光检测器分别进行测定,对测量结果进行分析比较。



    1 材料与方法

    1.1实验原理

    牛磺酸在碱性条件下与丹磺酰氯发生衍生反应,衍生产物C18反相色谱柱分离后,紫外检测器或荧光检测器检测

    1.2 实验方法

    依据GB 5413.26-2010第二法,在此基础上略有改动。

    1.3 仪器

    Waterse2695高效液相色谱仪(配有2998型光电二极管阵列检测器及2475多波长荧光检测器),美国Waters公司;pHS-3C型酸度计,上海雷磁仪器厂;恒温水浴锅,上海跃进医疗器械厂;超声波清洗机,宁波新芝生物科技有限公司。

    1.4 样品预处理

    准确称取5g样品于100mL容量瓶中,加入80mL温水(50~60)溶解,充分混匀后超声10min,冷却至室温。分别加入2mL亚铁氰化钾(质量分数10.6%)和2mL硫酸锌(质量分数30%)溶液,摇匀后用超纯水定容并过滤,滤液备用。

    吸取1mL上述滤液至5mL具塞玻璃试管中,加入0.5mL碳酸钠(pH9.8),混匀后加入0.5mL丹磺酰氯溶液(2g/L),充分混合,45水浴避光反应1h(中间摇晃1次),反应完成后加入0.2mL盐酸(1mol/L)中止反应,并用水定容至刻度。取上清液经0.45μm滤膜过滤后进样分析。

    1.5 色谱条件

    色谱柱:Waters SymmetryShield RP18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈:50mmol/L乙酸钠溶液(乙酸调节pH值为6.0=3070,使用前经0.45μm滤膜过滤;流速:1.0mL/min;柱温:30;进样量:20uL

    二极管阵列检测器检测波长:254nm

    荧光检测器:激发波长:330 nm;发射波长:530 nm

    2 实验结果与分析

    2.1 校正曲线

    准确称取0.010g牛磺酸标准物质于50mL容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,配成浓度为200ug/mL的标准储备液。分别吸取一定体积的标准储备液,按照样品预处理方法进行衍生,衍生后用水定容至5mL,配成浓度为04814202530ug/mL的牛磺酸标准工作液。依据上述色谱条件,用二极管阵列和荧光检测器分别对不同浓度的牛磺酸标准工作液进行测定,以样品峰面积Y对牛磺酸质量浓度X经过线性回归得到牛磺酸的线性回归方程,见图1。从线性回归方程中可以看出,在该浓度范围内,二极管阵列检测器测定的相关系数要优于荧光检测器,且这两种检测器对牛磺酸衍生物均具有较高的响应。在相同浓度下,对比两种检测器的响应值发现,荧光检测器的响应值远大于二极管阵列检测器,因此用荧光检测器测定能提高检测灵敏度。

    1 不同检测器测定牛磺酸校正曲线

    二极管阵列检测器测定校正曲线


    荧光检测器测定校正曲线



    2.2 精密度实验

    对同一标准工作液(8ug/mL)在相同色谱条件下进行反复测试,测定仪器及实验方法的精密度(RSD=6),实验结果见图2。从图中可以看出,不同检测器对牛磺酸标准工作液测定都具有很好的精密度。进一步考察该方法在实际应用中的表现。对牛奶加标样品进行重复测定(RSD=6),结果表明,该方法在实际样品中也具有很好的重复性和精密度。

    2 不同检测器测定牛磺酸精密度实验结果

    二极管阵列检测器测定牛磺酸标准工作液精密度实验结果(RSD=6


    荧光检测器测定牛磺酸标准工作液精密度实验结果(RSD=6

    二极管阵列检测器测定实际样品精密度实验结果(RSD=7

    2.3 色谱图

    3和图4分别为二极管阵列检测器和荧光检测器对标准工作溶液、婴幼儿奶粉、鲜牛奶及鲜牛奶加标样品在上述色谱条件下测定的液相色谱图。从图中可以看出,采用该方法能够较好的对乳及乳制品中的牛磺酸含量进行测定,并具有干扰少,响应值高,速度快等优点。对牛奶空白样品进行加标试样,结果表明,二极管阵列检测器和荧光检测器的回收率分别为95.32%93.67%

    3 二极管阵列检测器测定标准溶液及样品色谱图

    24ug/mL标准溶液色谱图1为DNS-Cl;2为牛磺酸衍生物峰


    婴幼儿奶粉色谱图


    牛奶空白样品色谱图


    牛奶加标色谱图

    4荧光检测器检测器测定标准溶液及样品色谱图

    24ug/mL标准品色谱图


    婴幼儿奶粉色谱图


    牛奶空白样品色谱图


    牛奶加标色谱图

    3 小结

    1)本实验以丹磺酰氯为衍生试剂,采用柱前衍生高效液相色谱法测定乳及乳制品中牛磺酸的含量,该方法具有良好的测定范围,准确度和精密度等优点。

    2)该衍生反应需在碱性条件下进行,且要避光反应。反应的时间、反应温度和衍生试剂加入量对结果的影响仍需进一步实验。

    3)丹磺酰氯对光和湿敏感,不稳定,最好现用现配。丹磺酰氯放置时间久了会生产二氯亚砜并继续分解成其他物质,影响其在有机溶剂中的溶解度。

    4)盐酸的加入,一方面是终止衍生反应的继续发生,另一方面可以调节溶液的pH值,因此加入不同体积的盐酸会改变牛磺酸衍生物的出峰时间,本文并未阐述。

    4 疑惑

    用荧光检测器测定时,在4min左右出现响应值波动很大的情况,用流动相稀释样品并未消除这一波动,想知道出现这一现象的原因,望高手解答。

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  • nphfm2009

    第1楼2014/05/15

    应助达人

    不错,支持下原创

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  • Franklin-学

    第2楼2014/05/15

    支持原创,支持科学

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  • hanmao

    第3楼2014/05/15

    图文并茂,不错。

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  • 童话仙子

    第4楼2014/05/18

    非常好的作品啊,我抽空看能写篇不呢

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  • h3595617

    第5楼2014/05/20

    用紫外检测器检测牛磺酸时,无论标品还是样品都会在40几分钟后出现疑是衍生物的杂峰,而且奶粉样品的杂峰很多,如果不完全跑完,目标峰很容易被盖住或与小峰重叠,但如果完全跑完有太耗时间,不知如何处理?荧光会不会有这种情况?

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  • 童话仙子

    第6楼2014/05/20

    这个是必须要检测的吗

    h3595617(h3595617) 发表:用紫外检测器检测牛磺酸时,无论标品还是样品都会在40几分钟后出现疑是衍生物的杂峰,而且奶粉样品的杂峰很多,如果不完全跑完,目标峰很容易被盖住或与小峰重叠,但如果完全跑完有太耗时间,不知如何处理?荧光会不会有这种情况?

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  • bingwang228

    第7楼2014/05/21

    应助达人

    我们在做实际样品时会在24min左右出现一个很小的峰,标准品后面没有杂峰,因此在做实际样品会将实际延后,避免干扰,延后到25min就可以了,没有干扰,也不会影响牛磺酸的检测,具体的精密度实验上面的表格中已经写出来了。我把实际样品的缩放图再贴出来。

    牛奶加标样品色谱图

    h3595617(h3595617) 发表:用紫外检测器检测牛磺酸时,无论标品还是样品都会在40几分钟后出现疑是衍生物的杂峰,而且奶粉样品的杂峰很多,如果不完全跑完,目标峰很容易被盖住或与小峰重叠,但如果完全跑完有太耗时间,不知如何处理?荧光会不会有这种情况?

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  • huangza

    第8楼2014/05/21

    应助达人

    支持原创,怎么有一倒峰呢?

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  • bingwang228

    第9楼2014/05/22

    应助达人

    我也比较奇怪,可能是衍生试剂的问题

    huangza(huangza) 发表:支持原创,怎么有一倒峰呢?

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  • 自营牧场

    第10楼2014/05/23

    牛磺酸的检测 主要是饮料里面的吧

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