CNW Athena C18-WP分析原料药及其杂质
实验目的
我们研究的样品为3.1类样品，其API包括一个位置异构体，其极性非常相近，当有250*4.6,5u C18色谱柱是，其分离度达不到药典标准，并且其流动相水相PH值为2.5±0.1之间，要求其耐酸性，为了更好的分离两物质并且耐酸的柱子，购买了Athena C18-WP。
实验方法及结果分析：
对色谱柱进行了试验考察：
1、色谱条件：
C18 250mm×4.6mm,3μm 柱温45℃，以磷酸水溶液（去离子水用磷酸调pH至2.5）为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱:
时间（分）
|
流动相A（%）
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流动相B（%）
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0.01
|
60
|
40
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60
|
10
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90
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60.01
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Stop
|
/
|
流速:1.0ml/min；检测波长：260nm ；进样体积：10ul
2、仪器与试剂：
高效液相色谱仪、电子天平
色谱纯乙腈、分析纯磷酸、异构体对照品、原料
3、线性溶液配制
取异构体和原料适量，用乙腈溶解并稀释制得各成分浓度均为0.3μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml、1.0μg/ml、1.2μg/ml、1.5μg/ml的混合溶液，作为系列浓度标准溶液。
表1原料线性测定结果
浓度（ug/ml） | 峰面积A | 相对于限度的百分率% |
0.317 | 11470 | 30 |
0.635 | 18896 | 60 |
0.847 | 26295 | 80 |
1.058 | 31570 | 100 |
1.270 | 38127 | 120 |
1.587 | 47483 | 150 |
结论：未知杂质的线性范围为0.317-1.587ug/ml（线性范围：至少在LOQ值-指标150%的范围内），符合验证方案要求。在此范围内线性回归系数r2为0.9978（回归系数r2：0.990-1.000）
表2异构体线性测定结果
浓度（ug/ml） | 峰面积A | 相对于限度的百分率% |
0.292 | 8127 | 30 |
0.585 | 16027 | 60 |
0.780 | 22786 | 80 |
0.974 | 28325 | 100 |
1.169 | 34780 | 120 |
1.462 | 43647 | 150 |
结论：杂质F的线性范围为0.292-1.462ug/ml（线性范围：至少在LOQ值-指标150%的范围内），符合验证方案要求。在此范围内线性回归系数r2为0.9991（回归系数r2：0.990-1.000）
4、定量限和检测限：
分别取异构体和原料混合溶液逐级稀释后进样，测定各成分主峰高与基线噪音的比值，当信噪比为3时作为检测限，当信噪比为10时作为定量限。
表3异构体的检测限和定量限测定结果
结论：异构体的最低定量限为 2.44ng，相对于样品溶液浓度的0.025%（LOQ≤0.05%），最低检测限为0.812ng，相当于样品浓度的0.0083%，符合验证方案要求。
表5原料的检测限和定量限测定结果
结论：原料的最低定量限为 2.64ng，相对于样品溶液浓度的0.025%（LOQ≤0.05%），最低检测限为0.881ng，相当于样品浓度的0.0083%，符合验证方案要求。
5、耐用性
通过改变流动相流速、柱温、不同PH来评估测定条件有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。要求分离度满足要求（≥1.5）
表6色谱条件变动的参数
表7耐用性试验结果
结论：改变流动相流速、柱温、不同PH，异构体相对保留时间基本一致，分离度满足≥1.5，最小分离度为1.665。
典型图谱：
5um柱子
定量限
检测限
耐用性 PH2.4
耐用性 PH2.6
经过对实验的完成得到的小结论为：该色谱柱在此方法下，除柱压有所增加，平衡梯度时间较长，大部分第一针都不能用，基线漂移值较大外，其他都可以。耐受酸性较强，对其耐用性好，可以对一品种完成其研究工作，希望以后能有更好的机会合作，并且希望贵公司能够生产出更适合研究工作用柱及生产用柱，使其重现性更好，方法转移更准确。
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