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液相色谱检测黄曲霉毒素的进展

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2014/10/07

食品毒素/微生物检测

高效液相色谱方法检测食品中黄曲霉毒素研究进展

由于黄曲霉具有极强的毒性和致癌性，大多数国家和地区都规定了食品中的限量要求，这就要求对黄曲霉毒素进行有效的监督，一方面可以保护公众的食品安全和健康，另一方面可以减少食品对外贸易带来的经济损失。高效液相色谱法是一种检测痕量物质常用的方法，检测黄曲霉毒素的一般步骤是用适合的溶剂提取目标物，净化浓缩，C18柱分离后检测器检测，根据检测器的不同，可分为荧光检测法和质谱检测法两类。

1提取和净化

样品提取溶剂的选择取决于黄曲霉毒素自身的物化性质，一般用到的提取溶剂有甲醇、乙腈的水溶液，尽管早期的方法中经常用到氯仿，但考虑到氯仿对环境的影响，现已基本上被替代；一些新的提取技术，如超临界流体萃取^[1,2]、加压流体萃取（加速流体萃取）^[3]被用于黄曲霉毒素的提取，但是超临界流体的提取物常有大量的杂质，而加压流体萃取设备价格昂贵，限制了其广泛使用。

样品的提取溶液中常含有共提取物，给黄曲霉毒素的检测带来干扰和基质效应。为了排除基质对分离和检测的干扰，常用的净化手段有液液萃取、固相萃取柱、免疫亲和柱和多功能净化柱。对于含油量大的样品，常需要在提取溶液中加入正己烷用液液萃取法去油；传统固相萃取柱在黄曲霉毒素净化方面的应用较早，填料主要有C18、硅胶、弗洛里硅土、氧化铝等，但由于选择性差，且往往既耗时又浪费溶剂，因此不及免疫亲和柱和多功能净化柱应用广，而微型固相萃取柱的应用便于建立简单快速、成本低廉的前处理方法。Mahoney^[4]等采用硅胶柱（30 mg/3 mL）建立了简单可靠的方法来分析检测来自不同植物源的油中黄曲霉毒素，结果表明硅胶柱可以选择性保留植物油中的黄曲霉毒素；Sobolev^[5]使用自制氧化铝柱（200 mg/1.5 mL）用于来净化检测主要农产品（玉米粉、棉籽、花生、杏仁、英国胡桃、巴西坚果、阿月浑果）中的黄曲霉毒素，该方法简单快速，成本低廉。由于弗罗里硅土对黄曲霉的吸附能力强，因此用弗罗里硅土柱净化洗脱需要用到大量的丙酮-水溶液^[6-8]；Sobolev^[9]对于弗罗里硅土柱（130 mg/1.5 mL）净化的的洗脱条件进行了研究，结果显示丙酮/水/甲酸(96:3.7:0.3, v/v)为洗脱溶剂时的洗脱能力最强，2 mL的洗脱体积即可得到大于98%的回收率；该净化方法用于花生、巴西坚果、玉米、棉籽等样品基质，其中花生基质中B₁定量限达到0.05 μg/kg；使用商品化的弗罗里硅土柱^[10]可以保证样品检测的重复性，同时可进行实验室间结果比对。

免疫亲和柱具有高效和特异性吸附的优点，可同时实现样品的净化和富集，达到比普通固相萃取柱更好的净化效果和更高的信燥比，而且有机试剂使用量少，因此免疫亲和柱越来越多用于黄曲霉毒素等真菌毒素的样品净化。AOAC对免疫亲和柱净化的黄曲霉毒素检测方法进行了协同研究^[11-14]；我国将免疫亲和柱用于黄曲霉毒素检测的国标方法（GB/T 18979-2003）。多种真菌毒素免疫亲和柱的商品化使同时净化分析多种真菌毒素成为可能，如人参和姜中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A的同时净化^[14]，谷物中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮三种真菌毒素的同时净化富集^{[15, 16]}；最新推出的商品化免疫亲和柱可实现黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏马菌素B₁和B₂、玉米赤酶烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）、T2和HT2共6种真菌毒素的同时净化，Lattanzo ^[17]，Bunaciu^[18]，廉慧锋^[19]和Soleimany^[20]分别建立了上述六种真菌毒素的同时净化方法，前处理均采用两步提取法，首先用磷酸缓冲溶液（PBS）提取，再用甲醇-磷酸缓冲溶液或甲醇-水溶液提取；Soleimany采用荧光检测器检测，其他采用LC-MS/MS检测。目前商品化免疫亲和柱仅适合甲醇-水提取溶液的净化，Uchigashima^[21]开发了一种新型的耐有机溶剂单克隆抗体MoAb2-3，在有机相高达40%的乙腈-水溶液和40%的甲醇-水溶液中能保持抗体反应性，该抗体和琼脂凝胶结合制成的免疫亲和柱可用于黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂和M₁的净化。免疫亲和柱的缺点是价格昂贵，针对性强，只能用于特定目标物的净化。

多功能净化柱采用通过的模式，柱管内为亲脂性(非极性)和具电荷活性成分（极性）的填料，保留样品提取溶液中的干扰物质如脂肪、蛋白质类化合物和碳水化合物等，而让待测化合物通过，从而达到净化的目的；多功能柱净化操作简单、用时短，已被国标GB/T 5009.23-2006和AOAC官方方法994.08采用，适用基质为玉米，花生和坚果；Akiyama^[22]和Khayoon^[23]分别将该净化方法的适用基质扩展到辣椒在内的调味品和大豆粉、混合饲料粉、向日葵、小麦、加拿大油菜、棕仁、椰子饼粉等。

固相萃取的另一种模式是基质固相分散，它是将样品和吸附材料混合均匀后填柱，然后洗脱，可以同时实现样品提取和净化。Hu^[24]分析比较了C18键合硅胶、硅胶、弗洛里硅土、中性氧化铝四种分散剂对黄曲霉毒素的提取和净化效果，发现氧化铝的效果最好，净化剂石墨化炭黑的用量对结果影响较大；并将以氧化铝柱为分散剂、石墨化炭黑为净化剂的基质固相分散技术用于辣椒粉、绿茶和黑芝麻等色素含量高的样品基质。

近年来，黄曲霉毒素和其他种类的真菌毒素的同时检测成为趋势。不仅因为多种真菌毒素的同时存在可能带来毒素协同作用，而且世界各国和地区对黄曲霉毒素之外的真菌毒素也作了法规要求，EC NO 1881/2006规定了食物中包括黄曲霉毒素在内的7类真菌毒素的限量要求，GB 2761-2011《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》中规定了黄曲霉毒素B₁，M₁，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON），展青霉素，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮共六种真菌毒素的限量；同时检测可以减少检测时间，降低样品的检测成本。然而，真菌毒素种类多且物化性质差别大，现有的某一类真菌毒素的提取净化方法很难完全适合其它种类真菌毒素，提取和净化阶段都可能造成某些待测物的损失，因此样品前处理步骤要尽量简单通用，典型的做法是稀释原始提取液直接进样（dilute and shoot）^[25-30]，提取溶剂一般选乙腈-水-乙酸溶液或乙腈-水溶液，这要求质谱检测器具有较高的灵敏度和选择性，还必须考虑基质效应。有些文献在前处理步骤加了净化以减少基质效应，除了上文提到的多真菌毒素免疫亲和柱外^[18-20]，还有改进的QuEChERS方法^{[31, 32]}即分散固相萃取、凝胶渗透色谱^[33]和多功能净化柱^[34]，C18和HLB固相萃取柱用于液体样品前处理时^{[35, 36]}，除净化外还有富集的作用。

2荧光检测法

荧光检测器在黄曲霉毒素检测中的应用较早，技术较为成熟。黄曲霉毒素共有的香豆素结构使荧光检测法成为首要检测方法，黄曲霉毒素在波长360nm的激发光下能发射出波长420nm的荧光。由于B₁和G₁分子的二呋喃结构中碳碳双键的吸电子诱导效应，致使分子荧光强度减弱，影响了方法的灵敏度和检出限。通过对双键衍生变成饱和碳碳单键可增强B₁和G₁的荧光强度，通常采用的衍生法有柱前三氟乙酸衍生、柱后碘衍生、柱后溴衍生和柱后光化学衍生，这四种衍生方法目前均被AOAC官方方法采用。柱前三氟乙酸衍生时需要在前处理部分增加衍生步骤，增加了前处理的时间以及结果的不确定度，同时B₁、G₁的衍生产物B_2a、G_2a存在稳定性的问题。碘衍生法是饱和碘溶液和B₁、G₁在60～75 ℃下发生衍生反应，由于衍生池增加了柱后死体积，易造成色谱峰变宽，且每次都要配制新鲜的溶液。溴比碘的氧化性更强，反应效率更高，但由于溴本身不稳定，不宜直接作为衍生试剂使用，衍生时采用以下两种方式，一种是在柱后衍生泵中加入三溴化吡啶鎓（PBPB），室温下与B₁、G₁发生反应；另一种是在流动相中加入溴化钾和硝酸，利用Kobra cell仪电化学在线产生的溴进行柱后衍生。光化学衍生（PHRED）是将反应线圈绕在紫外灯外，当流动相进过反应线圈时，B₁、G₁被衍生成荧光较强的B2a、G2a，类似于B₁、G₁和三氟乙酸的反应。Walking^[37]将光化学衍生和Kobra cell电化学衍生法、碘衍生法进行了比较，在花生中光化学衍生具有和后两者相当的效果，但在玉米中偏差较大。除化学衍生外，环糊精也可以增强黄曲霉毒素B₁、G₁和M₁的荧光强度，不过环糊精和黄曲霉毒素间的作用机制尚无定论。荧光检测法需要在提取阶段进行比较才彻底的净化，任何残留的荧光性杂质都可能造成对阳性的误判，报出假阳性的结果。荧光检测法必须确保目标物的完全分离，当其他真菌毒素和黄曲霉毒素同时检测时，就对分离提出了更高的要求。

3质谱检测法

液相质谱联用随着大气压电离技术尤其是电喷雾离子源的发展逐渐成熟，成为检测黄曲霉毒素强有力的手段。首先，三重四级杆质谱扫描速度快，定量能力要好于其它类型的质谱；其次，三重四级杆质谱的多反应检测模式具有较高的灵敏度和选择性，因此对样品的净化要求低，可适当简化前处理步骤；另外，相对于荧光检测器，质谱在检测黄曲霉毒素检测时无需对B₁、G₁进行衍生，省去了衍生步骤，因此，高效液相色谱三重四级杆串联质谱（LC-MS/MS）法完全可以克服荧光检测法出现的问题，在真菌检测中受到普遍的欢迎。

根据欧盟委员会决议2002/657/EC^[38]，三重四级杆质谱与液相联用检测时每种待测物至少需要一个母离子和两个子离子，而且两个子离子的离子强度应该保持在相对稳定的比例水平。母离子一般选择加氢准分子离子[M+H]⁺，子离子中一个为定量离子，另一个为确认离子，表1中列出了四种黄曲霉毒素的质谱参数。

表1 黄曲霉毒素的母离子和子离子

化合物
母离子（m/z）
子离子（m/z）
黄曲霉毒素B₁
313.0
285.0; 241.0
黄曲霉毒素B₂
315.0
259.0; 287.0
黄曲霉毒素G₁
329.0
243.0; 283.0
黄曲霉毒素G₂
331.0
245.0; 257.0

影响质谱灵敏度的主要因素是离子化效率，而共流出物的基质效应会影响待测物的离子化效率，表现为离子抑制或离子增强，大部分情况下为离子抑制；对于不同基质和待测物，可通过比较基质匹配校正曲线和溶剂校正曲线的斜率来考察基质效应^[17]。为消除基质效应的影响，通常采取适当的方法进行校正，如采用基质匹配校正法、标准加入法^[39]或者稳定同位素内标法校正^{[33, 40]}，从而可以可到更加准确的结果。黄曲霉毒素¹³C同位素的商品化使在分析测试时更方便采用同位素内标法，宫小明^[33]使用商品化U-[¹³C₁₇]-黄曲霉毒素B₁作为黄曲霉毒素的位素内标，Veronica^[41]使用四种黄曲霉毒素各自的¹³C同位素作为内标进行测定。除商品化同位素内标外，Cervino^[40]通过B₁和G₁双呋喃结构中碳碳双键的催化氘化反应合成氘标记的B₂和G₂，并将两种内标用于食品中黄曲霉毒素的LC-MS/MS稳定同位素稀释分析。此外，标准加入法和同位素内标法还可以补偿待测物在前处理过程的损失。

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第1楼2014/10/09

这个好像和另外一个重复了。

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这个没做过，有难度吧

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这个试验还没做过了。

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