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替硝唑输液中亚硝酸根的测定

牛一牛

2014/11/23

私聊

化学药检测

根据替硝唑的结构，本品中替硝唑可能有亚硝酸盐降解物产生，该降解物有致癌作用，需对亚硝酸根进行检测查。由于限于公司试验条件，无离子色谱，只能开发一种现有条件下可行的方法。

由于亚硝酸根无紫外吸收，经过文献查询可以采用衍生化法测定亚硝酸根的含量。

1. 衍生化方法

1.1衍生化反应原理

芳伯胺和亚硝酸盐及过量的酸在低温下反应生成芳香重氮盐，重氮盐与芳胺在弱酸性溶液中发生偶联反应，生成偶氮化合物。

1.2衍生化试剂的确定

参考BP2010甲硝唑注射液中亚硝酸根的测定方法（Metronidazole Intravenous Infusion和Metronidazole Sterile Solution）和中国文献“重氮化偶合HPLC法测定食品中的亚硝酸盐含量”、“N-（1-萘基）-胺光法”、“甲硝唑注射液中亚硝酸盐测定”，先以对氨基苯磺酸作为重氮化试剂和N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐和8-氨基萘磺酸作为偶联试剂进行衍生化，经过一系列实验比较，发现以对氨基苯磺酸作为重氮化试剂和N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐作为偶联试剂衍生化的效果好，且衍生物比较稳定。故选用对氨基苯磺酸和N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐为本法的衍生化试剂。结果见表1。

表1 2种文献衍生化方法比较

文献

BP2010 Metronidazole Intravenous Infusion

甲硝唑注射液中亚硝酸盐测定

重氮化试剂

3.3g/L 对氨基苯磺酸，以冰醋酸-水为溶剂，溶解性好。溶液为淡黄色。

10g/L 对氨基苯磺酸，以盐酸-水为溶剂，溶解性好。溶液为淡黄色。

偶联试剂

3.3g/L 8-氨基萘磺酸，以冰醋酸-水为溶剂，超生2h，未完全溶解。溶液为紫红色。

1g/L N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐，以水为溶剂，超生5min，可完全溶解。溶液为浅橙色。

衍生试液放置颜色变化

放置7天后对氨基苯磺酸溶液仍为淡黄色，8-氨基萘磺酸溶液渐变为暗紫红色。

放置7天后对氨基苯磺酸溶液仍为淡黄色，N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐溶液为仍浅橙色。

衍生物的稳定性

亚硝酸钠衍生后的溶液放置，用HPLC的方法测定其峰面积：

时间(hr)	0	4	24
吸光度	0.152	0.170	0.183
时间（hr）	0		20
峰面积	35139		30451

结果表明：20h亚硝酸钠衍生溶液峰面积减少，表明其衍生化物不稳定。

亚硝酸钠衍生后的溶液放置，分别用UV和HPLC的方法测定其吸光度和峰面积：

时间(hr)	0	2	4	8
吸光度	0.579	0.575	0.575	0.575
时间(hr)	0	2	4	8
峰面积	211094	213626	209922	210622

结果表明：8h内亚硝酸钠衍生溶液吸光度和峰面积无明显变化，表明其衍生化物稳定。

结论：

1、N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐试液放置颜色基本不变，8-氨基萘磺酸试液放置颜色会发生变化；

2、亚硝酸根与以“对氨基苯磺酸和8-氨基萘磺酸”为衍生试剂形成的衍生物溶液不如以“对氨基苯磺酸和N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐”为衍生试剂的稳定。故选用以“对氨基苯磺酸和N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐”为衍生试剂。

1.3 衍生化时间和加入衍生试剂的量的确定

参考BP2010标准注1、2和文献注3、4、5，分别加不同量的衍生化试液的量和在暗处放置不同的时间以确定对照品溶液及供试品溶液中的亚硝酸根与衍生化试剂完全反应。

亚硝酸钠对照品溶液（考察衍生时间）：精密量取耐用性试验中亚硝酸钠储备液2ml至250ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取此溶液5ml，加对氨基苯磺酸试液2ml，再加N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐试液2ml，摇匀，置暗处分别放置30min、60min和90min。加水稀释至刻度，摇匀。

亚硝酸钠对照品溶液（考察加入衍生试剂的量）：精密量取线性试验中亚硝酸钠储备液2ml至250ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液5ml，分别按表2 加入三个体积衍生试液的量，摇匀，置暗处放置60min。加水稀释至刻度，摇匀。

表2 加衍生试液的量

加衍生试液1ml

加衍生试液2ml

加衍生试液3ml

先加对氨基苯磺酸试液

1ml

2ml

3ml

再加各加N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐试液

1ml

2ml

3ml

分别测定上述溶液的吸光度和HPLC峰面积，结果见表3。

表3 衍生时间和衍生试剂耐用性

衍生时间	吸光度	HPLC峰面积	衍生试剂	吸光度	HPLC峰面积
30min	0.412	288162	1ml	0.401	284265
60min	0.410	289840	2ml	0.410	289840
90min	0.409	286145	3ml	0.416	288714
RSD（%）	0.37（n=3）	0.52（n=3）	RSD（%）	1.85（n=3）	1.02（n=3）

结论：变化不同衍生时间和加入不同衍生试剂的量，亚硝酸盐衍生物的吸光度稳定、且达到最大，RSD值分别为0.37%、1.85%，HPLC峰面积稳定，RSD分别为0.52%、1.02%。表明结果不受衍生时间和衍生试剂量的微小变化影响，衍生时间和加入衍生试剂的量合适。

2. 分析方法的确立

本衍生化产物有苯环共轭体系，有可见-紫外吸收特征，可用紫外和高效液相两种分析方法对本品中亚硝酸根进行测定。这里以紫外分析方法为例加以阐述。

2.1 UV法测定波长的确定

取空白衍生液和衍生后的亚硝酸钠对照品溶液适量，用水稀释5倍，以水为空白，进行紫外扫描，由图可知空白衍生液在400-600nm处无吸收，亚硝酸钠衍生物在546nm有最大吸收波长，故选546nm为紫外测定波长。

确定了UV吸收波长，接下来就要考虑方法的专属性，继而进行一系列分析方法验证，这里就不详细叙述了。

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