片姜黄提取物14种挥发油的抗肿瘤活性研究试验

片姜黄提取物14种挥发油的抗肿瘤活性研究试验

从国内外对姜黄挥发油的药理活性的研究报道发现，姜黄挥发油具有显著的抗肿瘤、抑制细胞增殖的作用。他们可通过直接杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞生长或转移、诱导肿瘤细胞凋亡或诱导肿瘤细胞分化使其逆转、增强和刺激机体免疫功能等多种方式起到抗肿瘤作用。

本研究采用体外方法评价了从片姜黄中提取分离得到的14种挥发油单体化合物在体外对HL-60(人白血病细胞)、Du145(人前列腺癌细胞)、Hep-3B(人肝癌细胞)、U87(人胶质瘤细胞)的细胞毒活性。实验结果表明，部分受试化合物显示出不同强度的抗肿瘤活性。

挥发油单体结构式如下：

实验部分

1实验材料

1.1受试品

14个单体化合物(化合物1-14)由合作单位离得到并进行结构鉴定，阳性对照购自药店。

1.2 实验细胞株

HL-60(人白血病细胞)，Du145(人前列腺癌细胞)，Hep-3B(人肝癌细胞)，U87(人胶质瘤细胞)，购自ATCC

2实验试剂

RPMI1640培养基：Gibco

胎牛血清：天津市灏洋生物制品有限公司

甲基偶氮唑盐(MTT)：美国Sigma

二甲基亚砜(DMSO)，NaCl，KCl，KH₂PO₃，Na₂HPO₃，NaHCO₃：沈阳化学试剂厂

酶标仪：奥地利TECAN

96孔细胞培养板：Costar公司

3.试验方法

3.1药物的处理

药物的溶解：各单化合物均为粉末状，使用DMSO溶解。配成浓度为100mmol/L的母液，储存于－20℃。临用时用相应的培养液将其稀释为100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L及0.1μmol/L进行实验。DMSO配置的样品进行实验时，DMSO的终浓度为1‰。阳性药5-FU、依托泊苷的浓度为100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、和0.1μmol/L。

给药处理：取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μl/well，培养于37℃，5%CO₂的培养箱内。培养24h后，换液加药，作用72h。分设空白组、给药组和阳性对照组，每组设5个复孔。

3.2MTT检验

MTT法的基本原理

细胞成活率测定采用MTT分析法，以活细胞代谢还原四甲基偶氮唑盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiahiazoy1)-3,5-di-phenyl-tetrazolium bromide, MTT)为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下四氮唑环开裂，生成蓝色的Formazan结晶，Formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。死细胞中此酶消失，不能和20％的十二烷基磺酸钠(pH4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm出的光密度OD值，OD值的大小与所生成的Formazan结晶的量成正比，从而反应出药物对细胞成活率的影响。

3.3MTT法的测定方法

药物作用72h后，将细胞与0.25mg/mlMTT于37℃下共同孵育4h，吸除培养液后每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，完全溶解后使用酶标仪于490nm测定其光密度OD值。最后以空白组OD值为100%，计算各组细胞抑制率。

4.、统计方法

全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误(Mean±S.E.)表示，采用One-WayANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett或Dunnett’sT3检验进行组间比较。

5、IC₅₀的计算方法

将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC₅₀。

结果与讨论：

从片姜黄中分离得到的化合物中选取14个单体化合物，采用MTT法(Metllvl-Thiazol-Tetrozolium,MTT)筛选了单体化合物对HL-60(人白血病细胞)、Du145(人前列腺癌细胞)、Hep-3B(人肝癌细胞)、U87(人胶质瘤细胞)人肿瘤细胞的体外细胞毒活性，结果见表：

对HL-60 (人白血病细胞)、Du145(人前列腺癌细胞)、Hep-3B(人肝癌细胞)、U87(人胶质瘤细胞)人肿瘤细胞体外细胞毒活性的测试结果显示，化合物1具有显著的细胞毒活性，对HL-60、Du145、Hep-3B三种人肿瘤细胞株有显著的抑制活性，IC₅₀值分别为：23.61、38.36、31.98μmol/L。化合物2对Du145有中等的抑制活性，IC₅₀值为：55.88 μmol/L。化合物4对Hep-3B有中等的抑制活性，IC₅₀值为：46.76 μmol/L。化合物5对Du145和U87有中等的抑制活性，IC₅₀值分别为：36.80、41.36μmol/L。已知化合物中，化合物7对HL-60、Du145、Hep-3B均有中等的抑制活性，IC₅₀值分别为：10.17、23.18、38.34 μmol/L。化合物8对HL-60、Du145、Hep-3B均有一定的抑制活性，IC₅₀值分别为：75.14、14.25、98.45 μmol/L。化合物9对HL-60、Hep-3B有不同程度的抑制活性，IC₅₀值分别为：31.98、83.20 μmol/L。化合物10、11对Du145、Hep-3B均有一定的抑制活性。化合物12对Du145有中等的抑制活性，IC₅₀值为25.73μmol/L。