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以黑箱理论讲解分析方法验证

happy王子矜

2015/07/31

私聊

化学药检测

关于分析方法验证，有各种各样的指南可以参考，但是实际操作过程中，我经常被看到很多同行或者更多是新手吧，把指南中一些语句神圣化，教条化，仿佛不这么做天就会塌下来，地球就会倒回2012毁灭一样。实际这是缺乏对方法验证的基本概念的理解。这种情况在长期做分析实验的QC分析人员上比较少见，反而常见于新手QA管理人员。
新手QA管理人员对于教条的某些理解，反过来强加到QC操作人员上，而操作人员不一定可以用完整的理论解释说服上级领导，于是各种求助帖，以及吐槽领导的帖子就冒了出来。本文的目的在于将方法验证的基本原理，也就是为什么这样验证告诉广大不了解QC分析的QA工作人员，所以这属于半个内行忽悠外行的文章，如果有内行同志发现词不达意或者漏洞百出的地方，千万不要客气，悄悄私信我把，不要让他们看到。
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本文使用黑箱理论（计算机学科里面的黑盒测试就是这样的过程）解释了方法验证中各个项目和环节，所以，先普及一下理论基础：
黑盒测试就是将我们要进行的测试，在测试中，把分析方法以及所有将要进行的验证操作看作一个不能打开的黑盒子，在完全不考虑分析方法所基于的化学原理以及分析仪器运行原理情况下，进行操作实验，它只检查分析方法是否可以按照检测目的的要求正常工作，稳定的输入能否产生稳定的输出，至于郎伯比尔什么的，不要在意那些细节，这和我们的实验无关。
黑盒测试就是不管分析方法本身是如何运作的，只要我在前端输入了稳定的溶液，进样到仪器中，仪器输出的结果是稳定的对应关系，那么实验成果良好，方法验证通过。如果不能，则不通过。
接下来，我们通过各项细节来一一说明
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1精密度
按照黑盒理论，精密度就是在输入环节提出的要求，每次输入同样的数据（同一浓度的样品溶液），得到的输出数据，也就是峰面积，必须也有很高的一致性，否则，测试就无法继续。举个例子，我们的检测规格要求含量在98%~102%之间。我拿了个99%的对照品，如果精密度不够，就会出现一次测试结果98.5%，一次103.5%，然后再来个97.2%，完全不能愉快的测试了。
精密度是我们测试的基础之一，如果没有这个，稳定的输出对应稳定的输入无从谈起，黑盒测试可以宣布失败了；那么，有了精密度就能一切顺利了么？显然答案是否定的，如果我们输入的是99%对照品，得到一组95.2%，95.1%，95.1%，95.3%，95.0%，95.2%的数据，精密度倒是很好，然而并没有什么用。于是，我们还需要进行其他实验。
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2检出限/定量限
这俩值是看溶液最小输入的。简单讲么，就是说，我们输入数据（溶液浓度）的下限是多少，小于这个值，我们的实验就无法进行了，就跟弹钢琴力气太小不发声音一样。输入一定浓度的溶液，得到了色谱图，我们看峰高和噪声的比值（信噪比），一般认为信噪比2或者3的时候，勉强可以在色谱图里面分辨出来，这就相当于1分贝的声音，也就是人耳可以勉强听到的极限，这就是检出限；当图谱可以很明显的计算峰面积，相当于你可以比较明显的听出来钢琴弹的是致爱丽丝还是水边的阿狄丽娜，这就是定量限，一般规定为信噪比10.
检出限和定量限的结果一般为某个浓度，这个浓度就是输入值的下限了，不能超过，否则我们的实验就超过了定性/定量的理论范围了。那么，是不是高于这个定量限的值就可以随便输入，并且可以得到稳定的输出呢？答案是否定的，如果你背过朗伯比尔，那么你会记得一个词，稀溶液。浓度越高，输入和输出的偏离越高，到底什么浓度合适呢，往下看。
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3线性范围及相关系数
据度娘讲，线性回归是利用统计学中的回归分析，确定两种或两种以上变量间相互依赖的定量关系的一种统计分析方法。不要觉得eggs pain，我翻译一下你就明白了，实际这就是讲的我们的黑盒试验。我们要确定的就是某种输入（变量1，我们进样的溶液浓度）和我们的实验输出结果（变量2，我们得到的峰面积）之间存在着非同一般的关系。还不明白的话，二次翻译，浓度低得到的峰面积小，浓度高得到的峰面积大，而且大小倍数关系应该高度一致，懂没？
理论上，最好这俩变量之间的关系亲密恒定如数学规律一般（y=kx+b），但是实际我们得到的数据可以会略有偏离，我们需要确定这个偏离不至于很大。无异议，这属于极为关键的评估项目。
说到这里请注意，我们并不需要做一番科学研究，验证某物质适用于朗伯比尔定律（或者其他对应关系）的范围到底是多少，我们只需要这东西在我们的检测需要的范围内靠谱就行。这要求我们的线性范围必须覆盖我们可能出现的正常检测结果。线性范围一般需要选五个点或以上，太少了在数学上不够严谨，至于为什么请参考统计学教材。选点原则么，如果你的正常检测结果对应的浓度接近1，那么线性范围验证0.8,1.0,1.2，再加上定量限，这适用于一般的主含量检测方法。如果是溶剂残留，一般检测结果可能会比指标值低很多，那么就另外在低浓度选几个点。如果是中控或者其他检测，检测结果可能的范围很大，那么你可能需要比较宽的线性范围，覆盖你的需要。
确定好范围，我们在这个范围里面验证相关性，结果用相关系数R表示，计算公式相当复杂我就不说了，反正你也不会自己算。我就解释一下判定系数R²的意思，如果R²=0.5，这说明y变量的改变有50%都是因为x的改变引起；如果R²=1，那么就是完美对应啦，数学规律在上；如果R²=0，也很简单，这说明y和x之间没有什么关系。线性验证的结果一般用相关系数来要求，化学合成的药物0.999是比较容易达到的，残留溶剂受顶空进样器的限制，0.99就算不错，生物类以及其他前处理回收率不太高的，相关系数可能更低。
范围确定了，是不是万事大吉呢，肯定不是了，我们还需要搞定其他的干扰。
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4专属性
如果单从分析角度来说，专属性项目验证很简单，保证我们检测的目标物峰和其他峰的分离度大于1.5就行（分离度1.5可以保证两个物质99.7%的分离，数学在上~）。从方法设计出发的话，需要考虑很多问题，比如，检测目标物如何确定，目标物的限度确定到多少合适，没有研发人员的配合，这个项目只能走过场。
检测目标物大致从下面范围挑选：最后两步的中间体，最后两步加入的重要原料，以及主要反应副产物，产品降解产物等，从这中间找最有可能残余在产品中的化合物，作为目标物。至于目标物的限度如何要求，需要查毒理性质，有时也看自己的工艺，这不完全是一个技术性问题，但是一定要找有技术背景的人来判断。听说很多厂家申报新药的时候都会根据自己的工艺把某几个目标物限度规定的很严格，用他们可以轻松达到的事情给后来人添堵。
这是一般合成API产品检测的专属性测试，还有残留溶剂方法验证、制剂产品方法验证的专属性，和这个是有些区别的，不过看了上面的解释，相信各位可以自己琢磨了，我就不多说了，这算是留个问题给各位观众吧。
讲到这里，基本上对于黑盒理论解释的方法验证会有一个概括的理解了，稳定的输入对应稳定的输入，成功再向我们招手了，来吧，最后一步！
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5准确度
这是方法验证的核心部分，就算我们做到了上面的所有要求，理论上还是会有一种我们不希望看到的结果，例如我们输入了代表量值为95%，100%，105%的数据，得到的是190%，200%，210%的结果，即使完全满足了1234各项要求，仍然是个重大问题。为了避免这种情况，我们将验证方法的准确度。
准确度验证一般使用加标回收法，实验原理非常简单，先输入待确认的数据（样品），得到数据A；然后输入部分已经确认的数据（标样）和待确认的数据（样品）的混合体，也就是把样品和已知浓度的标样进行混合进样，得到一个输出数据（混合结果）B。将混合结果B减去A，再除以我们加进去的确认数据（标样），得到一个数值，就是我们平时所称的加标回收率。为了避免数学上可能存在的漏洞以及我们上述的1234项原因，加标回收率试验需要在不同的浓度进行三次（药典在上~）。一般来说，80%，100%，120%是常用选择，如果能加上定量限的回收率就更完美了。回收率的限值根据不同的检测需求，有不同的确认符合的范围，化学合成API的检测是最严格也是最容易控制的，回收率一般会要求到98%~102%，制剂类可能会放宽到95%~105%或者更多，生物制剂或者溶剂残留更宽。
以上就是基于黑盒理论解释的方法验证的理论部分了，实际操作中，出于各种各样的原因，我们可能还需要对一个分析方法的其他项目进行验证。下面开始补刀：
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6其他项目（破坏性试验，溶液稳定性试验，方法耐用性试验等）
6.1破坏性试验
就是模拟待检样品可能出现的被破坏的情况，比如被酸碱腐蚀，被氧化，高温或者光照破坏等等。如果这些变化产生，那么我们的检测方法需要保证不受到其干扰。通俗翻译就是，不管你怎么破坏，破坏成了什么样子，破坏的产物出峰位置不能离目标峰太近，否则就会直接影响到我们的检测方法的可靠性。如果破坏性试验不通过，想想什么后果吧亲们：某产品被氧化变质，氧化产物和原主要物质出峰时间一致，然而你复测的时候什么也没有发现！细思恐极！
6.2溶液稳定性试验
为什么验证这个也很简单，你放一个进样瓶在那里，如果产品在溶剂里面发生了分解或者其他变化，那么所得到的结果就会随着时间的增加一步步的偏离我们的期望，所以我们需要隔一段时间把一瓶已经测过很多次的样品折腾一下，看看它有没有什么变化，这个实验完成后，你可以在你的方法里面声明在xx小时内，样品溶液稳定。计算方法同精密度试验。
6.3方法耐用性试验
由于许多不可抗力的影响，我们的输入数据甚至我们的黑盒子都并不处于一个恒定不变的状态，比如我们的分析仪器，你设置了液相流速1.00mL/min，实际就是这么多么？设定了气相柱温箱温度60℃，实际可能都略有偏差。另外不同的人配制溶液的习惯手法不同，调流动相pH值的水平不同，这都会影响我们的试验。方法耐用性试验就是验证这些值在一定范围内发生变化的时候，对我们整个的输入输出结果影响不大。试验方法也很简单，你不是担心流速设置和实际值不符么，我索性设置个0.95mL/min，再来一个1.05mL/min，如果这样搞结果没有影响，那么这一项耐用性通过。同理，气相的柱温箱改一点，pH值改一点，换个实验人员配个样试试看，等等。
这里我多说几句，很多旧文章上建议耐用性试验应该比设定值偏2个pH单位，我觉得这种验证方案大部分时候毫无必要也并不科学，本身缓冲液体系就保证了pH就算调节不到位，波动也是在一定范围以内的，2个单位太大，差个0.5单位很了不得了。而且如果我用的0.1%三氟乙酸缓冲体系（pH1.7左右），然而理论上三氟乙酸在水里面达不到pH=-0.3的，化学规律在上。
耐用性试验只是模拟可能出现问题的情况，如果你根本没用到缓冲液，就用纯水纯甲醇/乙腈，那么完全没必要做pH的耐受，但是存在有机相水相比例存在误差的可能，所以你需要做两相比例的耐用性测试。这个道理同其他的耐用性试验，各位QA同志们写文件抄网上的时候切记不要什么都抄，要对你验证的方法有了解。
最后补充一点，耐用性试验并不是防呆试验，你硬要说我们的实验员可能调pH值波动在两个pH单位，硬要说有可能实验员把甲醇拿成乙腈来测试，这就不是我们方法验证可以避免的，我们也不管这个事儿。
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说到这里基本差不多了，本文能够完成，需要感谢影子和vintie等多位审稿员的辛勤审阅，并提出了珍贵意见。另感谢论坛官人双双的辛苦催稿，使我这样的重度拖延症还有完成的可能，我会告诉你们这是我去年就打算写的题目么？
另外本文想法来源于百度三体吧韩度技术的帖子老韩扯中医在此表示感谢.

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