改良Quechers方法结合UPLC-MSMS快速分析食品中天然除虫菊酯的6种有效成分

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2015/08/14

私聊

液质联用（LCMS）

改良Quechers方法结合UPLC-MSMS快速分析食品中天然除虫菊酯的6种有效成分

1 背景：
现在日本谈起食品安全，在更多的时候是指进口食品的安全问题，比如美国产牛肉所牵涉到的BSE（狂牛病）问题，中国产蔬菜的残留农药问题等等。在牵扯到日本国产食品的时候也多与进口食品有关，一些不良商人以次充好，以普通食品冒充高档食品，以进口食品，尤其是从中国等国进口的食品冒充日本国产食品等等。日本消费者运动中最重要的一点就是在《消费者保护基本法》中明确规定了：“消费者有向国家和地方政府要求国家和地方政府完备有助于保护消费者权利的司法和行政系统的权利”。日本官方通报的进口食品安全事件每月都有，然而未通报的，经过消费者反馈的安全事件几乎天天有，诸如产品中混入其他异味成分、玻璃碎片、小塑料片、虫子等等，均被拍照作为证据，并向工厂一一索赔，这对中国工厂质量管理提出更高层次的考验。
夏秋两季，水果蔬菜大批量上市，而夏秋两季出口日本的食品中关于蟑螂、苍蝇、蚂蚁等各种虫子的反馈尤为增多。这对加工环境的要求更为苛刻。食品工厂等喷雾杀虫剂的选择尤为重要，天然除虫菊素是从天然除虫菊花中萃取，对蝇、跳蚤等昆虫均有击倒、杀死与驱避的效果。具备微毒、无残留、气味低及不产生抗药性等优点。适于与人、宠物接触、及置放食品区域等场合。

除虫菊酯也叫除虫菊素，是由除虫菊花(Pyreyhrum cineriifoliun Trebr)中分离萃取的具有杀虫效果的活性成分. 它包括除虫菊素I(pyrethrinⅠ)、除虫菊素II(pyrethrinII)、瓜叶菊素I(cinerinⅠ)、瓜叶菊素II(cinerinII)、茉酮菊素I(jasmolin I)、茉酮菊素II(jasmolinII)组成的。天然除虫菊素见光慢慢分解成水和 CO ，因此用其配制的农药或卫生杀虫剂等使用后无残留对人畜无副作用，是国际公认的最安全的无公害天然杀虫剂。喷洒该类杀虫剂虽不直接接触食品，但有可能随着空气飘散迁移至食品中。日本肯定列表中大多数产品规定除虫菊素的限量为1.0mg/kg，除小麦粉等外实行0.01mg/kg一律基准。国内没有相关限量标准，也没有关于除虫菊素的检测标准方法，也鲜有相关检测方法的报道。

2 试验目的：
基于改良的Quechers方法，采用0.1%醋酸乙腈和安谱dSPE萃取盐包萃取，dSPE纯化管净化，结合UPLC-MSMS，快速分析食品中六种天然除虫菊酯有效成分，在0.001~0.383mg/L范围内线性相关系数R2≥0.995，回收率在86.1%~102.7%，RSD<9.1%，方法检出限低于0.01mg/kg，满足出口食品限量要求，同时为制定相关标准提供参考。
3 试验方法
3.1 标准品配置：
PyrethrinsTechnical mixture购自Sigma-Aldrich，CAS号：8003-34-7，纯度21.75%,其中除虫菊素I(pyrethrinⅠ)占10.35%、除虫菊素II(pyrethrin II)7.26%、瓜叶菊素I(cinerinⅠ)占1.51%、瓜叶菊素II(cinerin II)占1.40%、茉酮菊素I(jasmolin I)占0.69%、茉酮菊素II(jasmolinII)占0.54%。
储备液：准确称取标准品92.6mg与50mL容量瓶中，用乙腈（色谱纯级，CNW货号4.003306.0500）溶解并定容至刻度，混合均匀，配置成混合标准品，其中除虫菊素I(pyrethrinⅠ)191.7mg/L、除虫菊素II(pyrethrin II)134.4 mg/L、瓜叶菊素I(cinerinⅠ)28.0 mg/L、瓜叶菊素II(cinerin II)25.9 mg/L、茉酮菊素I(jasmolinI) 12.8 mg/L、茉酮菊素II(jasmolinII)10.0 mg/L,0-4℃存放备用，有效期半年。
工作液：准确吸取上述储备液261μL于50mL容量瓶，并用乙腈+水（1+1）定容至刻度，使除虫菊素I浓度为1.0mg/L，吸取上述除虫菊素I浓度1.0mg/L溶液适量，分别配置除虫菊素I浓度为0.01mg/L，0.02mg/L，0.05mg/L，0.10mg/L，0.20mg/L五点梯度标品作为工作液。
3.2 前处理方法
提取：称取15.0g样品于50mL离心管中，加入15.0mL0.1%醋酸乙腈溶液，剧烈震荡1min，加入盐包SBEQ-CA8115-1-B（6g无水硫酸镁，1.5g无水乙酸钠），剧烈震荡1min，4000r/min离心5min。
净化：去1mL上清液加入DispersiveSPE 2mL Cean Up Tubes中。剧烈震荡1min，10000r/min离心1min。去上清液500uL加入500uL超纯水，混合均匀，过0.2μmPTFE滤膜，LCMSMS检测。
注：Tube管的选择如下：一般果蔬：SBEQ-CA8319（150mg无水硫酸镁+50mgPSA）；含脂肪和蜡状物果蔬：SBEQ-CA8425（150mg无水硫酸镁+50mgPSA+50mgC18）；含叶绿素果蔬：SBEQ-CA8534（150mg无水硫酸镁+50mgPSA+50mgGCB）；含色素和脂肪的果蔬：SBEQ-CA8642（150mg无水硫酸镁+50mgPSA+50mgC18+50mgGCB）。
3.3 仪器分析方法
仪器型号： WatersI-Class-Zevo TQ-S
进样体积：1μL
色谱柱：ACQITY UPLC HSST3 1.8μm 2.1×100mm Column
流动相：A 0.1%甲酸水，B 0.1%甲酸乙腈
洗脱梯度：表1 洗脱梯度参数

Time（min）	Flow（mL/min）	%A	%B	Curve
Initial	0.45	60	40	Initial
0.6	0.45	50	50	6
2.5	0.45	5	95	6
4.0	0.45	5	95	6
4.1	0.45	60	40	1
4.5	0.45	60	40	1

3.4 质谱参数：
采集模式：ESI+
毛细管电压：2.0kV
去溶剂气温度：400℃
去溶剂气：氮气发生器-氮气
去溶剂气流量：900L/Hr
锥孔反吹气：150L/Hr
碰撞气流量：0.16mL/min
离子源温度：150℃
质谱采集参数：表2 质谱MRM采集参数

名称	母离子（M/Z）	锥孔电压（V）	子离子（M/Z）	碰撞能量（V）
瓜叶菊素I(cinerinⅠ)	317.2	20	107.0	20
			121.0	20
			※149.0	12
除虫菊素I(pyrethrinⅠ)	329.2	20	133.0	15
			143.0	15
			※161.0	5
茉酮菊素I(jasmolin I)	331.2	20	※107.0	20
			121.1	18
瓜叶菊素II(cinerin II)	361.2	20	107.1	18
			※149.1	10
除虫菊素II(pyrethrin II)	373.2	20	133	15
			143	10
			※161	5
茉酮菊素II(jasmolinII)	375.2	20	107.1	20
			121.0	20
			※163.1	10

注：标※的为定量离子
1 结果分析及讨论（色谱图，标准曲线，空白基质，加标浓度，回收率等）

5.1 质控浓度及回收率

表3 三种基质2浓度3平行回收率及RSD

化合物名称	质控浓度 mg/kg	大头菜回收率（n=3）	RSD	白萝卜回收率（n=3）	RSD	大姜回收率*（n=3）	RSD
Cinein I	0.0029	91.9%	3.0%	102.5%	9.1%	90.5%	3.1%
Cinein I	0.0560	99.6%	1.5%	94.7%	7.6%	93.5%	3.3%
Pyrethrin I	0.0200	91.0%	0.5%	91.7%	1.4%	89.9%	3.9%
Pyrethrin I	0.3830	92.5%	0.8%	95.1%	1.0%	87.5%	4.6%
Jasmolin I	0.0014	98.4%	1.9%	98.1%	2.3%	86.8%	2.9%
Jasmolin I	0.0260	86.1%	5.2%	94.1%	1.3%	92.4%	3.9%
Cinein II	0.0027	89.0%	5.2%	93.9%	0.7%	88.4%	1.9%
Cinein II	0.0520	96.2%	4.6%	98.5%	4.9%	95.5%	2.2%
Pyrethrin II	0.0140	93.3%	0.4%	92.1%	0.6%	92.0%	3.2%
Pyrethrin II	0.2690	90.2%	3.4%	92.6%	1.0%	96.2%	4.6%
Jasmolin II	0.0010	94.1%	5.5%	93.2%	0.8%	102.7%	8.6%
Jasmolin II	0.0200	95.0%	6.2%	94.2%	9.0%	99.2%	3.4%

注：大姜回收率*：由于大姜基质效应较强，再此方法中采用基质标品定量。
本实验采用大头菜、白萝卜和大姜三种基质，每种基质做了两个浓度的回收试验。大头菜和白萝卜基质效应<5%，可以使用溶液标准曲线5点线性定量方法定量，大姜的基质效应在40%左右，根据实验室内部要求：在基质效应>10%情况下，需采用基质标准曲线进行校准。因此大姜中6中除虫菊酯采用基质标品定量方式。其他基质的定量方式还需进一步试验验证。
1.2 标准曲线

表4六种化合物标准品浓度及线性

化合物名称	标品浓度mg/kg	曲线方程	R^2
Cinein I	0.0015,0.0029,0.0073,0.0146,0.0292	y=205100×x+8.93091	0.996947
Pyrethrin I	0.01,0.02,0.05,0.10,0.20	y=145759×x-59.1546	0.999581
Jasmolin I	0.0007,0.0013,0.0033,0.0067,0.0133	y=239380×x-11.1094	0.996392
Cinein II	0.0014,0.0027,0.0068,0.0135,0.0270	y=477950×x-18.5987	0.999904
Pyrethrin II	0.007,0.014,0.035,0.070,0.140	y=441991×x-67.1527	0.999822
Jasmolin II	0.0005,0.001,0.0026,0.0052,0.0104	y=812025×x+15.8374	0.998295

1.3 自称填料与CNW成品填料比对
自行购买散装填料，经烘制等处理后，人工称量规定的质量，制作自填填料，相对比CNW成品的价格相对便宜，但人工自填填料存在称量质量大小不一，相对误差较大，且存在漏称某种填料的风险，并且超细粉末如PSA，C18和GCB的随空气的飘散，与皮肤接触或呼吸吸入，都有一定的健康危害。而且通过实验数据可以看出使用CNW成品填料检测的RSD明显小于自填填料实验的RSD（见表5），成品填料的相对风险较低，性价比更高。

化合物名称	质控浓度 mg/kg	CNW填料大头菜回收率（n=3）	RSD	自填填料大头菜回收率（n=3）	RSD
Cinein I	0.0029	91.9%	3.0%	89.8%	9.5%
Pyrethrin I	0.0200	91.0%	0.5%	90.7%	10.4%
Jasmolin I	0.0014	98.4%	1.9%	91.1%	8.3%
Cinein II	0.0027	89.0%	5.2%	82.9%	7.7%
Pyrethrin II	0.0140	93.3%	0.4%	80.1%	2.6%
Jasmolin II	0.0010	94.1%	5.5%	83.2%	7.8%