仪器信息网APP

选仪器、听讲座、看资讯

立即体验

当前位置：仪器社区 >环境监测 > 土壤固体废弃物监测 > 帖子详情

紫露草微核实验

空空的天空

2015/08/26

土壤固体废弃物监测

一、目的和要求
(1) 学习紫露草的生物特性、栽培管理与紫露草微核实验的原理及其操作方法。
(2) 掌握监测与评价多种污染理化因子对紫露草花粉母细胞遗传毒性的生物技术。
二、原理
紫露草（Tradescantia)是一种多年生草本植物，属鸭拓科、紫露草属，易无性繁殖，分生多，减数分裂期具有高度同步性。在减数分裂时，其花粉母细胞染色体比有丝分裂中的染色体对污染物更为敏感，且染色体在各时期的敏感性不同，在处理大量同步分裂的敏感花粉母细胞时，在四分体中能观察到染色体损伤断裂而形成的微核。其自然本底微核率较低，微核形成过程短，适宜用于监测。
紫露草微核实验技术是利用花粉母细胞减数分裂中的染色体作为受击目标，以四分体内所形成的微核频率为监测指标。在花粉母细胞减数分裂早期，受到污染环境中的各种诱变理化因子的作用，染色体发生断裂，断裂的染色体片段由于丧失着丝点，不能移向细胞两极，在四分体时期形成。.5-3. 0μcm的微核，游离在四分体胞质中。该微核出现的频率可反映出环境污染物对真核生物的生殖细胞染色体损害的程度。
三、仪器与试剂
(1) 显微镜及其照相设备。
(2）计数器。
(3）卡诺氏液。无水乙醇，冰醋酸＝3，1(现用现配）。
(4) 70％乙醇。
(5) lmol/L盐酸。
(6) lmol/L氢氧化钠溶液。
(7) 1％乙酸洋红。将100mL 45％冰醋酸水溶液倾入250mL锥形瓶中，文火煮沸，缓缓投入1. 00g洋红粉末，煮沸1.2h，在该溶液中悬吊一小铁钉，煮沸1. 5min取出，或当溶液冷却后加入1-2滴乙酸铁溶液，使溶液中含有适量铁离子，以便增加染色效果。溶液经过滤后分装于棕色试剂瓶中保存于暗处、备用。
(8）待测物。视需要而定。
(9）实验生物。紫露草（Tradescantia paludosa Clone # 3)，中国海洋大学从美国引进由江苏省植物研究所提供。无性繁殖株。地栽或盆栽，最适宜温度21-26℃，夜间16℃左右，湿度60%-80%，光照强度在1800-2000lx，每日光照14h,施加粪肥或饼肥，忌用化肥，以保证紫露草持续开花，自然突变本底低。
四、实验步骤
1．花序采集
每个处理组至少采15个花序，随机采集生长健壮的紫露草花枝，其花序顶端开的第一朵花一般有10-13个花蕾，花序下带有2片叶子，花枝长5-8cm，置于无污染自来水中，备用。
2．调节代浏物pH
用lmol/L盐酸或lmol/L氢氧化钠溶液调节待测物的pH至5.5-8.5。
3．待浏物浓度的选择
采用等间距对数浓度或百分浓度，经预试后确定5^-6个浓度组，并设一阴性对照组。
4．花序处理
将配制好的各浓度待测物溶液分别盛入500mL烧杯中并进行编号。烧杯上蒙以带孔的塑料膜或带孔塑料板，每个处理组和对照组各插入15个花枝，进行培养处理，处理时间视待测物的毒性和pH而定，1-6h。在人工或自然光源下培养处理一般需6h。每个处理组与对照组需设2--3个平行样。
5．恢复培养
更换处理花序杯内的自来水，在常温和人工光照下连续恢复培养24h。
6．固定及保存
将恢复培养后的花序剪下，去掉叶和花梗，浸在新配制的卡诺氏液中固定24h，再将花序移入70％乙醇中，于4℃冰箱保存，备用。若需长期保存，每月需要换1次70％的乙醇。
7．压片与染色
取一固定好的花序，选择从顶端向下数第7一8个花蕾，用解剖刀把花蕾从中央劈开，用解剖针和镊子打开花蕾，剥出花药，置于载玻片上，滴1滴乙酸洋红，稍加挤压，置100倍显微镜下观察，若大部分为四分体，则充分捣碎花药，去除花粉囊等杂物，小心盖上盖玻片，在酒精灯火焰上过5-6个来回，盖上多层吸水纸，用拇指轻轻挤压盖玻片，置显微镜下观察计数。如染色过深，则在一端滴1滴45％乙酸溶液，在另一端用吸水纸吸引掉，使之稍加褪色。如染色过浅，可在盖玻片的一端滴1滴乙酸洋红，在另一端用吸水纸吸引过多的染色液。
8．观察与计数
(1) 检片时采用双盲片法，即封死原制片的样本号后，打乱原制片的顺序，重新编码。
(2) 在低倍镜下观察选择四分体细胞分布均匀，染色好的区域，再在400倍显微镜下观察，以一个四分体为一个检视单位，进行计数。为避免重复，以“Z”形路线移动观片。每张制片至少检视300个四分体作为一个样品群体。记录含有1、2、3、4、5个微核的四分体数。
(3) 形态观察。早期四分体胞质中的微核，其直径为0. 5～3 μm，呈圆形或椭圆形分布在主核周围，着色与主核一致，进行显微照相。
(4) 揭开加封码，记录真实编号，待结果分析。
五、数据处理
(1) 微核形态观察计数。
(2) 按公式计数微核率。
微核率=（微核总数/四分体总数）100%
(3) 处理与评价。
根据记录的所有样品群体的结果，计算其平均值、标准偏差和标准误差，以平均值差的标准误差公式，来鉴别处理组和对照组间差别的显著性。
Sd＝√(SEt)²＋(SEC)²
式中：Sd——平均值差的标准误差值；
SEt——处理组的标准误差值；
SEc——对照组的标准误差值。
当平均值差等于或大于平均值差的标准误差值2倍时，表示处理组的平均值与对照组平均值差异显著（(5％以下的概率），从而评价大气或水体是否受到诱变剂污染及污染水平。
六、注意事项
(1) 必须选用早期四分体时期的花蕾进行压片，这是实验成功的关键。
(2) 乙酸洋红制备过程中要用文火煮沸，加铁离子切忌过量，掌握悬吊铁钉的煮沸时间。
(3）严格控制染毒、恢复、固定的时间。
(4) 平均微核率为3个样品群体的平均值。
(5) 实验材料的本底微核率不得超过10%，如同一处理组的重复实验微核率相差2％以上，应重做。
【关键词】紫露草微核实验

相关话题

近期热榜

热门活动

猜你喜欢最新推荐热门推荐更多推荐

品牌合作伙伴

日立科学仪器

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

珀金埃尔默仪器（上海）有限公司（PerkinElmer）

日本电子株式会社

赛默飞世尔科技

马尔文帕纳科

上海仪电科仪

梅特勒托利多

布鲁克核磁

举报帖子

点赞用户

好友列表

加载中...

正在为您切换请稍后...