液相色谱流动相的选择问题，你了解多少？

老多_小多

2015/11/16

私聊

液相色谱（LC）

1、流动相溶剂的选择

流动相溶剂的正确选择对于高效液相色谱分析(HPLC)的成功与否非常重要。目前还没有一个较为理想的选择模式，

主要依赖于经验的积累。流动相溶剂选择的一般要求是：

(1)溶剂应当是高纯度，溶剂与固定相不互溶，并能保持色谱柱的稳定性；

(2)溶剂的性能与使用的检测器应当匹配；

(3)溶剂对样品应有足够的溶解能力；

(4)溶剂应具有低的粘度和适当低的沸点；

(5)尽量避免使用具有显著毒性的溶剂。在选择流动相溶剂时，可以从影响分离度R 的因素即柱效、分离因子a和容量因子来考虑。选择溶剂时首先应排除一些物理性质(如沸点、粘度、紫外吸收等)不适于在液相色谱中使用的溶剂，然后选择能使分析样品中组分的容量因子值保持在1～1O之间、洗脱强度适当的溶剂。对含多组分的样品、值可扩展在0．5～20之间。在选出适用值的溶剂当中，还要进一步选择能将样品中的不同组分分离开、且能使每个相邻组分的分离因子a大于1．05的溶剂。所选择的适用Ic，和a的溶剂还必须与能提供高理论塔板数的色谱柱相组合。因此，作为一个色谱工作者，熟悉表征溶剂物理和化学特性的重要参数，如溶剂强度参数￡‘、溶解度参数占、极性参数P、粘度．rl等，对液相色谱法流动相溶剂的选择会起到十分重要的作用。能够作为液相色谱流动相使用的溶剂有100多种，但实用的溶剂只有少数几种。在实验室中有了甲醇、乙腈、水、四氢呋喃、正己烷、二氯甲烷，就能够解决9O％以上的色谱分离问题。
2、溶剂的处理与更换
液相色谱溶剂应尽量使用HPLC级溶剂。HPLC级试剂是用特殊方法生产的含有最少的微粒和最低的紫外吸收物质。水也应达到HPLC级。液相色谱实验室应配有纯水发生器。非色谱纯溶剂可通过蒸馏方法进行提纯，除掉大部分有紫外吸收的杂质。另外，用氧化铝或硅胶柱可除去极性强的化合物。完全由HPLC级溶剂组成的流动相不必过滤，其他溶剂由于含有不溶性微小颗粒，会逐渐堆积在色谱柱中堵塞流动相的通道，使柱压力升高，柱效率下降，因此使用前一定要用0．2～0．5μm 的过滤器过滤。当使用固体化学试剂(如缓冲盐)配制流动相时过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵的单向阀、阻塞、损坏进样器和柱头过滤片。现有过滤器有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择。过滤水溶性流动相时(如甲醇／水)，先用1～2 mL甲醇润湿过滤膜，有助于快速抽滤。流动相在使用前必须进行脱气处理(连同贮液器一起脱气效果更好)，以除去其中溶解的气体，防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。若在死体积检测池中，存在气泡会增加基线噪声，严重时会造成分析灵敏度下降。流动相中的氧气对光电检测器影响最大，使紫外检测器基线增高，低波长检测时信号被抵消掉。在荧光检测中Oz会使样品的荧光淬灭，降低灵敏度，还会导致某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有① 氦脱气；② 加热回流；③ 真空脱气；④ 超声波脱气。从脱气速度和效果看，加热回流法最好，但操作不方便，存在着火的危险。对于混合流动相不提倡用此法，因为挥发性组分会损失掉，改变流动相的组成。超声脱气法只能除去3O 的溶解气体效果最差。近年来新出现的在线真空脱气法(on—line degasser)，把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现了流动相在进人输液泵前的连续脱气。其脱气效果明显优于上述4种方法，并适用于多元溶剂体系。在HPLC中需要经常更换新溶剂。更换溶剂时，必须将原有的溶剂冲洗干净。如果新旧溶剂是互溶的，则必须保证新溶剂使色谱柱重新达到平衡。否则将产生基线漂移。若新旧溶剂不互溶，则要选择与原溶剂和新溶剂(正相和反相)都相溶的过渡溶剂冲洗，然后再用新溶剂冲洗。如异丙醇是1种很理想的过渡溶剂。特别要注意防止新旧溶剂发生反应或生成沉淀物，否则将给管路、泵及检测器带来污染和堵塞，给清洗工作带来麻烦。如果缓冲液反相流动相被正相流动相所污染，产生缓冲盐沉淀，可用5倍柱体积的非缓冲液反相流动相冲洗系统，再用1O倍柱体积的强溶剂(如乙腈)通过系统，最后用5O倍柱体积的异丙醇冲洗系统，以除去所有滞留的流动相和溶剂残留，换上反相流动相冲洗，使系统重新平衡。如果正相流动相被水溶性溶剂所污染，先用5O倍柱体积的异丙醇冲洗，而后用正相流动相冲洗。在分析样品前，最少需用1O倍体积的最终流动相冲洗系统。

3、溶剂与检测器的匹配
前面已提到溶剂的性能应当与使用的检测器匹配，在使用紫外可见光检测器时，需选用无紫外吸收特性的溶剂作流动相。样品测定波长应当在溶剂紫外吸收波长上限以上，噪声降至1O ～ 10一AU，才能保证检测的灵敏度，才能用于梯度洗脱。流动相溶剂在整个梯度范围内互溶性要好，尽量减少溶剂折光指数对溶剂组成梯度的影响。溶剂折光指数的改变会导致紫外吸收度的变化，使紫外检测器产生噪音和漂移。因此，当使用两种或两种以上溶剂做梯度时，其折光指数应该尽量接近，尽量减少溶剂紫外吸收度改变的影响。在使用示差折光检测器时，应使流动相的折光指数与被测样品的折光指数有尽可能大的差别，因为二者的折射率差别越大，检测器的响应信号越大，检测灵敏度越高。示差折光检测器一般不用于梯度洗脱，这是因为随溶剂组成的改变，流动相的折光指数也在改变，无法使基线稳定。使用荧光检测器时，不能使用可熄灭、抑制或吸收荧光的溶剂作流动相。溶剂的极性和溶液的温度对荧光强度有明显的影响。增大溶剂的极性，导致荧光增强。通常荧光物质溶液的荧光效率和荧光强随着温度的升高而降低。此外，当样品浓度较高时，易引起荧光猝灭效应和内滤效应，溶液浓度越大，该效应越显著，溶液中的其它成分，特别是顺磁性物质的存在，将使猝灭效应加剧。因此，在进行荧光检测时，试样要配成低于10 g／mL浓度的溶液，要使用不含荧光物质的溶剂。电化学检测器所用的流动相必须具有导电性。安培检测器采用的流动相中必须有常用浓度范围为0．01 mol／L~0．1 mol／L电解质(如含盐的缓冲液)存在。流动相要有足够高的介电常数，使电解质充分解离。流动相在电极表面呈电化学惰性，工作电压下背景电流小。

4、色谱柱的保护
色谱柱价格昂贵，保持色谱柱的柱效，容量和渗透特性、延长其使用寿命非常重要，防止柱性能下降可采用以下几方面的措施：① 溶剂的化学腐蚀性不能太强；② 避免微粒在柱头沉降；③ 泵上要装压力限制器，防止压力过高冲击过大，根据经验，设定泵上限压力在15~20 Mpa，带微机的系统还需设定下限压力，一般在0．5～ 1．0 Mpa；④ 流动相pHi7时用大粒度同种填料作预柱(饱和柱)，以保护分折柱免受流动相酸、碱的侵蚀；⑤ 柱头加烧结不锈钢滤片和保护柱，保护柱体积占被保护柱体积的1：1O～ 1：2O即可。对于硅胶键合相填料，要求pH 在2．5～ 7．5之间，极端pH 的流动相会引起基体硅胶溶解，使键合相流失。柱子在酸性或碱性条件下使用后，应及时用水、甲醇清洗，除去残留的酸或碱。水溶性流动相会引起微生物生长而造成阻塞柱。色谱柱应存放在纯有机溶剂或加了5O 有机溶剂的水中。凝胶柱可存放在水溶性缓冲液中，同时加0。01 oA叠氮钠以防止微生物的生长。键合相色谱柱使用一段时间，由于大量极性或非极性样品的连续注入。会引起固定相对样品的吸附、缔合等不良效应，使色谱柱钝化，分离性能变差，引起峰形加宽或拖尾等现象。此时应及时对色谱柱进行再生处理。其冲洗程序为：正相键合相柱：2O倍柱体积的9=50 oA 甲醇：氯仿一2O倍柱体积的醋酸乙酯一2O倍柱体积的流动相。反相键合相柱：1O倍柱体积的甲醇一1O倍柱体积的二氯甲烷一1O倍柱体积的正己烷一1O倍柱体积的二氯甲烷一1O倍柱体积的甲醇一2O倍柱体积的流动相。此外，也可以使用丙酮，二甲基甲酰胺或约0．01 mol／L无机酸水溶液进行再生处理。

5 溶剂与样品处理
样品的成分复杂，可能存在对色谱柱有害的物质或影响色谱分离效果的因素，需要对其进行前期处理和HPLC分离。如溶解、浓缩、过滤、萃取、衍生化和液相色谱(低压柱层折)。溶解样品应判明样品的极性选择合适的溶剂。溶解样品的溶剂应与使用的流动相一致，溶解样品的溶剂强度大于所使用的流动相的强度时，会损害色谱图的质量，此时应考虑样品的进样体积。为了减少色谱峰加宽效应，样品到达柱之前最后稀释液的强度应小于流动相强度的一半(如流动相是50 的乙腈：水，样品稀释液应小于25 乙腈：水)。样品进样前必须过滤，如果进样后压力突然增加而后又慢慢减小，表明样品中有微粒或发生沉淀。样品过滤的过程中可能会引起：样品被污染，因过滤吸附降低样品组分的含量，样品溶剂挥发引起误差。萃取是样品预处理的关键一步，要求萃取用的溶剂毒性低、挥发性好，杂质少、对待测样品有良好的溶解度且又与水不相混溶。常用的有乙醚、醋酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯或者两种以上的混合溶剂。水溶性混合样品可直接进样，而样品是从有机溶剂中萃取出来的，则需要进行稀释。用弱溶剂可使样品在柱头浓缩，不会因柱前连接管路使色谱峰变差。对于没有紫外吸收或无荧光的样品组分，则需要进行衍生化处理，这样既可以提高灵敏度，又可改善分离度。为了保持较高的反应产率和重现性结果，一般要求加过量的衍生试剂，此时溶剂的影响不容忽视，如溶剂会影响产率，尤其是极性溶剂和溶质之间有相互作用，溶剂对紫外吸收谱的强度、峰形和最大吸收波长等有一定影响。衍生化不利于样品纯化。
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