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液相色谱(LC)
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黄曲霉毒素的分析
shime
2004/06/09
私聊
液相色谱(LC)
食品中黄曲霉毒素的测定,主要有TLC、ELISA、HPLC 等方法,TLC法灵敏度和重现性较差;ELISA法重现性差,易受样品基质干扰假阳性率高,仅能作为筛选方法。近年来,由于HPLC法具有灵敏度和准确度高、方法重现性好等优点,现已成为黄曲霉毒素分析的主要手段。HPLC法测定黄曲霉毒素,一般使用灵敏度和选择性较好的荧光检测器。但由于黄曲霉毒素的荧光强度会受溶剂影响,正相色谱中,B1和B2的荧光强度仅稍低一点,不需衍生化;而在常用的反相色谱中,B1和G1两种异构体荧光强度很弱,需进行衍生化,提高其荧光强度,灵敏度才能满足一般食品法规的限量。衍生化的方法一般有柱前和柱后两类, 柱前衍生一般使用三氟乙酸,柱后衍生有碘液、过溴化吡啶溴以及电化学和光化学等方法。近年来,很多标准方法利用免疫亲合柱净化,HPLC柱后衍生对花生和玉米等农产品和食品中黄曲霉的含量进行了分析,方法检出限能够达到1 μg/kg以下。
Q1。免疫亲和柱的填料是什么,它是怎样工作的,为什么要用它?
免疫亲合柱对于欧们学化学的好像陌生了一点,不过你把它当成一种层析柱就行了。它的所谓填料就是固定了抗体的凝胶(黄曲霉毒素的柱子一般是单克隆抗体),基于抗原抗体反应进行工作,专一性很强,再加上另一种原理(反相或正相
液相色谱
)的分离,即使你把它当作确证方法也能说的过去。其实免疫亲和柱净化后的样品已经非常干净,直接加溴水也可在荧光分光光度计上进行测定,也是AOAC 991。31正式方法。现在还有一种普通霉菌毒素净化柱(不是免疫柱)要便宜一些,能做的霉菌毒素品种也多,但是专一性就差些。
Q2。Kobra cell可以在线产生溴,这对分析有什么作用?是可以提高灵敏度吗?如果是,溴是如何与黄曲霉素反应的?络合?氧化?还是别的什么?
由欧以上的论述,应该说是提高反相HPLC分析中黄曲霉毒素B1、G1的灵敏度。反应原理欧还真的没研究,可能和柱后衍生类似(氧化?),考虑到进入精益求精的要求还是不乱猜了吧。
Q3。看到书上说黄曲霉素的毒性是KCN的10倍,是砒霜的68倍。晕啊。。。操作时有没有特别的个人防护措施?
这个阿胖讲得差不多了,方法也就是用次氯酸钠溶液泡器皿,当然最好不要自己称固体标样,那东东有静电,很容易飞出来,买溶液就行了。
要补充的1、就是没阿胖讲的那么可怕,对欧盟出口花生及制品的检测实验室都使用免疫亲和柱净化-HPLC—RF法确证,每年可能要做上万个样品。2、HPLC法的干扰比酶免方法不知道要小多少,有的HPLC筛选方法,提取后不净化就直接进样了,也很少有干扰。采用哪种方法主要是和要求有关,如果让洋人拿着鞭子在后面抽着干,肯定是要用HPLC法;如果就骗骗中国的官僚和老百姓,那就像啊胖说的,酶免法又省钱有省事,嘿嘿。。。。3、GB/T 5009的TLC法,净化方法很差,UV灯下看上去是一条亮带,满足国标20PPB的限量都很勉强,这一点你可看看旧贴http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?BoardID=5&replyID=47615&id=18220&skin=0欧论述的也差不多了。
1、AOAC方法简述
25g均匀样品,加入氯化钠5 g和125 mL甲醇:水(7+3),均质2min,过滤。取15 mL滤液加30 mL水,再次过滤后,取10 mL过免疫亲和柱,2×10 mL水洗柱,最后用1 mL甲醇洗脱黄曲霉毒素,用水定容至2 mL,供HPLC测定。
HPLC条件:
色谱柱:4.6×250 mm, 5 μm,C18;
流动相:甲醇-乙腈-水(1+1+3);
流速:1.0 mL/min;
柱后衍生试剂:100 mg碘溶于2 mL甲醇,加水至200 mL。流速0.3 mL/min;
衍生化温度:70 ℃;
衍生化时间:55 s;
激发波长:360 nm;
发射波长:> 420 nm;
进样量:50 μL。
3. 方法技术指标:
免疫亲和柱净化,HPLC柱后衍生化的方法回收率
(1) 2000年AOAC协同试验结果
B1: 82- 109 %(添加水平:1.0- 5.0 ng/g)
B2: 77- 123 %(添加水平:0.2- 0.8 ng/g)
G1: 58- 93 %(添加水平:1.0- 5.0 ng/g)
G2: 62- 105 %(添加水平:0.2- 0.8 ng/g)
(2) 1991年AOAC协同试验结果
B1: 77- 90 %(添加水平:5.8- 17.5 ng/g)
B2: 55- 70 %(添加水平:0.83- 2.5 ng/g)
G1: 76- 98 %(添加水平:2.5- 7.5 ng/g)
G2: 36- 55 %(添加水平:0.83- 2.5 ng/g)
碘衍生化方法的反应温度要70 ℃,需要单独的柱温箱,还要一个打衍生剂的泵。故可以采用以下两种方法来代替碘溶液作柱后衍生
(1)过溴化吡啶溴(PBPB)衍生
色谱柱:4.6×250 mm, 5 μm,C18;
流动相:水-乙腈-甲醇(6+2+3);
流速:1.00 mL/min;
衍生化溶液:25 mg PBPB (CAS: 39516-58-3)溶于500 mL水,室温下避光可保存5天;
衍生化溶液流速:0.30 mL/min;
衍生化反应管:55 cm × 0.5 mm id.;
衍生化反应温度:室温。
(2)电化学反应池衍生
色谱柱:4.6×250 mm, 5 μm,C18;
流动相:水-乙腈-甲醇(6+2+3),每升加350 μL HNO3 (5 mol/L),同时溶解120 mg KBr;
衍生化反应池:Kobra cell; Rhone Diagnostics Technologies Ltd.,
衍生化操作电流:100 μA。
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2012/04/16
你好,还做黄曲霉毒素吗
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