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蜂哥花弟，二次相遇——0405

一片枫叶

2016/04/29

液相色谱（LC）

蜂哥花弟两地分离，疑难问题只能传递，花弟再次汇总难题，发送信息求解答疑；
蜂哥心里装着花弟，虽住两地心有灵犀，兄弟之情怎能忘记，有求必应方是正理！
花弟问题没有顺序，切看下面蜂哥答疑：
1：花弟：水的问题虽然简单，一直让俺十分为难，液相系统用水问题，征求蜂哥为俺答疑。
蜂哥：液相用水十分关键，选择不好分析困难，以己之见有这几点：
1：双重蒸馏水或者纯净水或者超纯水。
3：屈臣氏水或哇哈哈纯净水也是不错的选择。
2：纯水机——屈臣氏蒸馏水比哇哈哈纯净水好用。
2：花弟：根据下面分析条件，0.05摩尔每升三乙胺流动相怎么配制？

我这样配制对吗？

蜂哥：错了，应该这样配制！

3：花弟：流动相乙腈，0.2%磷酸水，走标品，为什么昨天今天的保留时间会相差十几分钟啊，条件操作之类的没改变啊，进行不下去了，忧伤~
样品是禾叶风毛菊提取物。流动相也重新配了。柱子今天也换了同等规格的。这2根柱子今天跑的情况差不多。

蜂哥：1：看看柱压，进样针有没有堵，压力波动大不大。
2：看看有机相和水相位置有没有放反了。
3：觉得是柱效不太行，先好好冲一下吧。
4：查实际流量，查流动相混合实际比例。
4：花弟：预开口的进样垫是怎么回事？
蜂哥：预开口的瓶垫，WATERS很喜欢用，有一字开口和十字开口。说到十字开口 waters 蓝帽回收瓶好像就是十字开口的。
5：花弟：分析一个批次的样品，进样101针，随行对照到后边Rsd超过百分之二，保留时间从11.2你min 到后边逐渐漂移 11.39到11.4到11.5到11.6，我怀疑是色谱柱接头松动导致出峰延迟，但是到后边随行对照溶液主峰峰高增加，峰面积变大怎么解释？

蜂哥：对照品稳定性不好，或者溶剂有蒸发，流动相用的缓冲盐么？
花弟：有缓冲盐，乙腈:缓冲盐，我是等度洗脱，之前跑过101针随行对照瓶盖子也没换过 Rsd符合规定的。序列运行到清洗程序时中断（5%乙腈流速0.6），大概50针时候样品压力在90bar 左右一直运行到101针差不多都是这个压力保留时间逐渐递增。
色谱柱压力上下波动在3bar，运行的平均压力是90～92bar。序列日志显示的是detecor leak。

蜂哥：看你数据可以认为实验成功，Rsd值可以接受吧，峰漂移要考虑柱子，管路，流动相等，如果标峰时适当调整窗口都能标出来就可以。
柱前（进样阀前）漏液与柱后漏液保留时间都延长，峰面积变化有差别。柱前（进样阀前）漏液与柱后漏液组分的保留时间都增大。柱前（进样阀前）漏液峰面积增大，柱后漏液峰面积减小。
考虑2个点，流动相的挥发导致比例变化，或者，环境问题变化导致分离度变化。看看进样器温度有时也会有问题。
花弟：柱前漏液对于每一针随行对照而言浓度增加程度相同理论上峰面积也应该与后边的一致，异常的峰面积也应该保持这个异常的峰面积才对，柱前漏液应该不会显示检测器漏液吧我的仪器是1260，序列日志显示的是detecor leak。
蜂哥：这种情况我觉得是日间和夜里温差太大的原因，保留时间的漂移也会导致积分的不准。
还有可能针残留，后一针的峰面积会更大。
环境因素——空调室温降低，保留时间增大。流动相组成改变——比例阀。流动相洗脱强度的降低，pH 值的改变。
6：花弟；请教大家一个问题安捷1200过滤白头我们现在一天一换每次换下的白头会发现中间有缩回去一点大家遇到过这种情况吗？

蜂哥：我们三个月左右吧，脱气压力超过1ba才更换。
花弟：我们以前也是这样现在是用一天之后就脱气压力13bar了。
蜂哥：过滤白头是PTFE的,本来就是有弹性的，如果有变形,是表明你的系统压力过高。特别要注意的是,流动相不要存放超过3天，容易长菌。估计是流动相不太干净，而且流动相瓶要经常清洗。
流动相,乙腈水,C18菲罗门的柱子,LUNA么?什么柱子，柱压多少？
花弟：用的时间比较久了正常压力170bar，但是新换白头用一天之后压力会达300bar。
蜂哥：那很高了，换个柱子看看，170bar相当于2500左右的pis。你乙腈水,LUNA柱,25cm的一般不超过1200pis，你再用下去,机器要报警了,一般设置在3000psi，如果换柱子压力还高,那么考虑泵头的问题,红宝石或者单向阀。
可以接个二通试一试吧，看看是不是系统堵了，如果是过滤白头的问题，那么purge的时候就有压力。
用纯水压力大于10就是过滤白头问题，过滤白头如果经常容易脏，就要怀疑泵的密封垫问题了。
花弟：为什么过滤白头容易脏要怀疑泵的密封垫？
蜂哥：频繁脏就是泵头密封垫磨损造成的。
花弟：问问各位这个purge阀过滤白头是在哪个位置？

蜂哥：purge阀拧下来，在那个里面，过滤白头是AGILENT的,WATERS木有。
7：花弟：在分析方法验证中，定量限是怎么做出来的，是逐步稀释出来的吗？稀释过程是怎么做的，有没有什么依据或指南？
蜂哥：一次性到位需要对自己的仪器当时的氘灯能量值预计准确，方法本身线性极好可以根据高浓度峰高直接计算出信噪比10，还有就是爆棚的运气。这样的运气一般没有所以常被怀疑跳图。
花弟：安捷伦1260是如何算出检出限的？

蜂哥：如何得到基线噪音和漂移以及信噪比结果
选择报告—>系统适用性—>编辑噪声范围，指定一段或几段平直的基线，将起始时间和结束时间输入，选择的时间范围尽可能接近目标峰，同时注意不要包含色谱峰。
选择报告—>设定报告—>性能+噪声报告。预览报告，就可以看到信噪比，噪音，漂移等参数。
噪声可通过一信号选定时间范围内的数据来检测，大家可以看到，我们的报告上分别得到了三个噪声结果，分别是用三种不同的计算方式得到的。
漂移线性回归校准偏差Sd 的六倍的噪声（6*SD）
峰峰漂移修正间的噪声（PtoP）
用ASTM 方法检测的噪声 (ASTM E 685-93
蜂哥：三个噪声意义是不一样的，取6*SD的噪声，计算信噪比，峰高/6*SD=信噪比，3*信噪比为检测限，10*信噪比为定量限。
8：花弟：仪器型号岛津20A，液相不出峰，什么问题呀！
峰哥：岛津20A不出峰
1：看检测器是否有响应应，若检测器有响应，工作站不出峰，就是工作站的问题，重启工作站。或者信号线接触不良，捏一下或动一下接线盒就好
2：若检测器没有响应，就是氘灯能量不足或流通池污染或流通池有气泡或光路老化污染。
9：花弟：新的色谱柱是如何活化处理的？
蜂哥：活化柱子——有机相有高比例到低比例过度，流速有低流速到高流速过度。
10：花弟：是不是灵敏度调越高响应值越大啊？
蜂哥：灵敏度是一方面，另外对于具有紫外吸收的目标物还与其在检测波长下是否具有最大的紫外吸收有关，
11：花弟：我想问一下哦，如果产物和杂质的最大吸收波长相差较大，这个时候波长该如何选择呢？
蜂哥：如果以分析目标物的有效含量为主，那么设定波长设定在目标物的最大吸收波长或附近，如果是分析目标物的杂质，那么要兼顾到二者都要有比较好的紫外吸收。
12：花弟：我现在分析一个新样品，有拖尾现象，其他的样品都不拖尾，不清楚怎么回事，要怎么解决啊？
蜂哥：要看你这个拖尾的物质是啥，有啥性质特点，目前柱子流动相是啥?
拖尾的原因很多——对于碱性的分析物，在柱子的耐受范围之内，适当地增加流动相的pH值可以有效地抑制拖尾的形成。酸性的流动相，分析物若显酸性，则降低pH值。分析物若显碱性，则没有保留或保留很弱。
柱子如果没封尾处理，做碱性化合物容易拖尾——对于硅胶基质键合相的色谱柱填料，在硅胶的表面键合了一定覆盖率的非极性键合相，没有被键合的硅羟基裸露在硅胶的表面，这部分硅羟基很容易与碱性的分析物形成蒂合而引起拖尾，为了有效防止裸露硅羟基对分析物的影响，对这部分裸露的硅羟基进行第二次的硅烷化键合就是端基封尾。
措施三点——减小进样量，调整pH值，更换色谱柱。
13：花弟：我走的基线噪声在0.5mAU，正常不啊？是不是流速低，噪声就要大些？
蜂哥：液相色谱仪噪声及漂移一般标准，基线噪声≤5×10-4 V（或AU），基线漂移≤5×10-3 V(或AU)/30min。基线噪声在0.5mAU以内是正常的。
基线噪音和基线漂移——选用C18色谱柱，以100%甲醇为流动相，流量为1.0ml/min，紫外检测器的波长设定为254nm，待仪器稳定后，记录基线30min，在图谱上读取噪音，基线噪音应不超过5×10-4AU。
在规定的检测波长下，对于正常的色谱系统，恒定的流动相和流速，噪声不应该增大。规定的检测波长——大于流动相的截止波长。正常的色谱系统——输液系统不存在污染，运行正常没有故障，检测系统没有污染。恒定的流动相和流速——流动相比例不发生变化，流速稳定。
14：花弟：岛津20A检测器波长准确度检测不通过怎么解决？
蜂哥：准确度检测不通过仪器会发出报警出现报错信息：CHECK NO GOOD。措施:检查流通池是否有气泡，流通池是否有吸收254nm和656nm的污染物。或者重新启动检测器。
15：花弟：我不接色谱柱，系统压力正常，接上色谱柱之后压力只大了0.5兆帕，柱子接在别的仪器也正常，是什么原因呢？
蜂哥：设定流速下，流量正常，压力偏低，就有可能是压力传感器的问题。设定流速下，流量偏低，压力偏低，可能是泵腔有气泡或吸滤头污染或单向阀污染或柱塞密封垫损坏或柱塞杆磨损。
16：花弟：请问：同一个色谱系统，用20ul 10ul 5ul 的定量环会不会影响系统压力？7725进样器5ul的定量环和20ul的定量环内径是不一样的，旁路和主路的压力会不会因为定量环内径的不同而发生变化呢？

峰哥：应该不会，因为由泵到进样器之间的管路内径小于0.18mm，所以没有影响。

17：花弟：我想问一下，waters的在线过滤器堵的话用什么超声？
蜂哥：Waters 在线过滤器堵塞会造成系统压力升高，其处理措施：1：用纯净水超声15min。2：再用异丙醇超声15min。3：如果还没有解决，就用5%的稀硝酸超声15min。4：最后，在用纯水超声，清洗干净。如果经过超声清洗还没有有效的解决，那么就要考虑更换在线过滤器的滤芯了。
只有Waters 和岛津液相才有在线过滤器，而安捷伦液相没有在线过滤器但有过滤白头。在线过滤器和吸滤头的清洗是一样的操作。
花弟听了一席课，茅舍顿开领会多，频频点头示言谢，欢迎蜂哥常做客！

相关话题

夏天的雪

第1楼2016/04/29

应助达人

好总结，欢迎继续

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一片枫叶

第2楼2016/04/29

应助达人

感谢雪版主支持！

0

happy水中月

第3楼2016/04/29

总结的不错，如果版主把每个问题分分类归纳，编个索引，那以后要找起来是不是更容易了呢？
一片枫叶(v2960432) 发表:感谢雪版主支持！

0

一片枫叶

第4楼2016/04/29

应助达人

嗯…好主意！一月搞一次索引还是有必要的。
happy水中月(lianlxh)发表: 总结的不错，如果版主把每个问题分分类归纳，编个索引，那以后要找起来是不是更容易了呢？

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zxmsjl

第5楼2016/04/29

支持版主。

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一片枫叶

第6楼2016/04/29

应助达人

感谢支持！
zxmsjl(zxmsjl)发表:支持版主。

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flyaway

第7楼2016/04/30

一眼看成蜂花
文章不错有点长

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一片枫叶

第8楼2016/04/30

应助达人

一周的汇总，还省去了许多，主要保留了不同见解的分析过程。
flyaway(flyaway) 发表:一眼看成蜂花
文章不错有点长

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