真菌毒素无处不在

小余儿

2016/07/12

私聊

液相色谱（LC）

真菌毒素无处不在

真菌毒素的检测方法
1 生物鉴定法
生物鉴定法利用真菌毒素能够影响微生物、家禽、水生生物等的细胞代谢过程来鉴定真菌毒素的存在，根据对生物体产生的病变、异常或死亡等判定真菌毒素的危害，该方法对样品的纯度要求较低，该方法主要用于定性分析，专一性较差，灵敏度较低，一般只是作为其他分析方法的佐证。
2 化学分析方法
化学分析方法检测真菌毒素主要包括以下步骤：提取、脱脂、净化、分离和鉴定。早期常用的化学分析方法有薄层层析法（Thin Layer Chromatography, TLC）和柱层层析法（ColumnChromatography,CC）。
在20世纪80年代，我国将TLC作为食品及饲料中黄曲霉毒素的标准测定方法（GB/T8381-1987），将样品经提取、净化和浓缩处理后，在薄层层析板上分离后，利用黄曲霉毒素在紫外照射下可发荧光的特性进行检测。张华报道的薄层层析法检测检测霉菌毒素的灵敏度为5μg/kg，方法的结果准确，重现性好，回收率为 85%-100%。用薄层层析方法己分离出黄曲霉毒素、杂色曲霉素、青霉酸和构巢曲霉素等。
柱层层析在真菌毒素样品前处理过程中得到了广泛的应用，柱层层折常用的吸附剂有氧化铝、活性炭、硅胶、镁等，将吸附剂填充到管中形成固定相，将样品提取液上柱，用流动相洗脱，利用样品中不同物质在固定相和流动相中分配系数的不同，实现样品中不同物质的分离，进而进行检测。利用亲和力不同的溶剂和不同固定相的组合可以形成不同分离能力的层析柱。
基于吸附剂进行前处理的柱层析分离技术对靶标物的选择性不强，近年来，基于免疫亲和层析技术的样品前处理在真菌毒素提取中应用逐渐广泛。免疫亲和柱是将真菌毒素特异性抗体通过一定方式偶联固定在载体基质上，装柱形成微柱，用于样品前处理。其工作原理是样品溶液中的真菌毒素在流经亲和柱时，载体基质上的抗体特异性的捕获样品溶液中的真菌毒素，使真菌毒素得到净化和富集，待上样完成后用高浓度的甲醇、乙腈等溶液洗脱，将真菌毒素释放出来，得到的洗脱液用于检测。
3 仪器分析法
仪器分析方法是对样品进行一定的提取、净化处理后，借助检测仪器设备对待测靶标物进定性、定量分析的技术。在真菌毒素的检测分析中，常用的方法有高效液相色谱法（HighPerformance Liquid Chromatography, HPLC）、超高效液相色谱法（Ultra HPLC，UHPLC）、高效液相色谱法与质谱联用方法（HPLC-tandem mass Spectrometry， HP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp]LC-MS/MS）、气相色谱与质谱联用法、高效液相毛细管电泳方法等。
HPLC 方法是 20 世纪 60 年代末在气相色谱基础上发展起来的一种以液体为流动相的新型谱技术，在真菌毒素的检测中常采用反向色谱法。近年来，在 HPLC 方法的基础上发展起来的UHPLC 和 HP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp]LC-MS/MS 方法比 HPLC 方法具有更高的检测灵敏度和检测通量。基于HPLC 的方法广泛的被国内外实验室和检测机构作为真菌毒素确证性检测方法。我国食品安全国家标准 GB541337-2010 中规定免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法和免疫亲和层析净化高效液相色谱法分别作为乳和乳制品中 AFM1测定方法。
HPLC 方法具有灵敏度高、测定结果准确可靠、特异性好的特点，基于免疫亲和柱前处理的HPLC方法与化学分析方法和生物鉴定法相比，检测时间缩短，对复杂样品的处理能力更强。但是仪器分析方法也有其缺陷，需要使用大量的有机溶剂，依赖大型精密仪器，检测成本高，需要专业的操作人员，不能满足现场快速筛查的需求。
4 免疫分析方法
免疫分析方法起始于20世纪50 年代，继 60 年代竞争分析原理提出后取得了巨大的进步，成为生物分析的重要手段之一。免疫分析方法从本质上说属于一种特殊形式的试剂分析法，将抗体作为核心分析试剂，基于抗体与抗原的特异性结合反应，对待测靶标物，包
括小分子化合物、大分子的酶、蛋白质等，进行定性和定量分析。抗体和抗原反应的典型特点是抗体能特异性识别抗原，并发生结合反应，这种反应是可逆的，抗体与抗原的专一性比一般分析试剂间专一性强。
免疫分析技术已广泛的应用于临床分析检测、食品安全检测、环境污染检测领域。免疫分析
技术最早出现的是放射免疫分析，由 Berson和 Yallow首次使用，该方法的灵敏度高、特异性好，但是其最大的缺点是分析过程引入放射性核素，对操作人员和环境造成危害和污染。
4.1 酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）是在免疫酶技术基础上发展起来的免疫分析方法，于 1972 年由 Engvall 首次用碱性磷酸酯酶标记免疫球蛋白用于 IgG 的测定。现已广泛的应用于分析检测领域，检测对象包括疾病诊断中的大分子检测，食品安全检测中的小分子污染物检测。
ELISA 方法的原理是将抗原或抗体与酶标记后形成酶标抗原或酶标抗体，既保持抗原、抗体的免疫活性，又具有酶活性，将待测物与酶标记抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面的抗体或抗原反应，洗涤去除未反应结合的物质，最后根据固相载体上酶的量与待测靶标物的对应比例关系进行定量分析。该方法根据反应模式的不同可分为夹心 ELISA 方法和竞争ELISA 方法，夹心 ELISA 方法主要用于检测大分子化合物，竞争 ELISA 方法主要用于检测小分子化合物。真菌毒素属于小分子物质，由于只有一个抗体结合位点，因此在真菌毒素的ELISA检测中常采用竞争分析模式。Wang等人建立了基于多克隆抗体检测AFM1的ELISA快速分析方法，对AFM1和 AFB1的检测灵敏度（IC50值）为分别为 0.014 和 0.02 ng/mL。Zhang等人研制了针对 OTA 的单克隆抗体，并用该抗体建立了间接竞争ELISA 方法
测定谷物中的 OTA，方法的检出限为 0.15 ng/mL，灵敏度为 1.7ng/mL，检测范围为 0.55-6.75 ng/mL。Burmistrova 等人建立的基于单克隆抗体的 ELISA 方法在 ZEA 的检测中，检出限为 0.1 ng/mL，灵敏度为。
4.2 免疫亲和方法
免疫亲和方法主要用于样品的前处理过程中，主要利用抗体对待测物的专一识别特性，对待测物进行净化和浓缩，能够有效的去除样品基质干扰，提高检测灵敏度和准确性。基于免疫亲和柱的色谱分离方法被我国国家标准和国际标准定为真菌毒素检测的标准方法。免疫亲和柱常与其他检测方法联用，Li 等建立了基于免疫亲和柱的 ELISA 方法检测农产品复杂基质中的 OTA，结果表明在 OTA 添加样品检测中，经过免疫亲和柱处理后的 ELISA 检测回收率明显较未经亲和柱处理的方法回收率高。
免疫亲和柱不仅可以用于样品前处理，还可直接在亲和柱上进一步反应进行定性或定量分析。Yu 等人基于免疫竞争反应原理建立了在免疫亲和柱上进行可视化检测 AFM1的方法，在样品上样完成后，再从亲和柱底端加入辣根过氧化酶（HRP）标记的 AFM1，洗脱后加入酶底物，进行显色，显色深浅与样品中 AFM1浓度成反比，根据显色深浅判别 AFM1的含量，该方法对 AFM1的灵敏度为 40 ng/L。Yuan等人基于免疫竞争原理，在凝胶上固定抗体后，制成免疫亲和柱，使其竞争性结合氯霉素和 HRP 标记的氯霉素，加入底物后显色，最终实现了对氯霉素的快速检测，方法的检出限为 1 ng/mL。
4.3 免疫层析方法
免疫层析方法是20世纪90年代在免疫渗滤技术基础上建立起来的，是以抗原和抗体作为生化反应物对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性或半定量分析的一种快速检测技术。该技术由于其简单、可操作性强、快速、成本低等特点，在疾病快速诊断、食品安全检测、环境污染监测等领域得到了广泛的应用。
免疫层析技术的原理是将特异性的抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜等载体的某一区带上，当样品和标记探针混合物通过层析作用在膜上移动并流经该区带时，样品中相应的抗体或者抗原即与膜上其对应的抗原或抗体发生特异性结合并富集，从而在该区带上显示出探针标记物质的颜色或荧光信号，并对其进行定性或定量分析，以实现特异性的免疫层析检测。

4.4 免疫传感器方法
免疫传感器属于生物传感器的一种，其反应原理是将高灵敏度的传感技术与特异性的免疫反应结合起来，用以监测抗原抗体的反应。免疫传感器与传统的免疫检测方法不同的是它不仅能够实现定性定量分析，还能够对整个反应过程进行动态监测。由于具有灵敏度高、特异性好、简便、快速等特点，在临床医学、食品工业、环境监测等领域得到了广泛的应用。
免疫传感器的检测结果需通过换能器转换成输出信号，其中换能器的精确度和稳定性直接影响免疫传感的检测结果。基于换能器在传感器中的重要作用，根据换能器的不同可以将免疫传感器划分为电化学免疫传感器、质量检测免疫传感器、热量检测免疫传感器、光学免疫传感器。电化学和光学免疫传感器的研究报道较多，Rejeb 等建立了基于乙酰胆碱酯酶抑制的电化学免疫传感器用于 AFB1的检测，通过对酶和底物浓度等反应条件进行优化后，方法对食品中 AFB1的检测灵敏度为 2 ng/mL，线性范围为 10-60 ng/mL，对 10 ng/mL AFB
1添加的样品检测回收率为 78±9%。Alarcón 等在丝网印刷的电极上建立了基于竞争性电化学酶联免疫吸附的免疫传感器用于 OTA的定量检测，直接和间接分析模式中，方法对 OTA 的检测灵敏度分别为 0.35 (±0.04)和 0.9 (±0.1)ng/mL，对小麦样品中 OTA 的检出限为 0.4 μg/kg，方法的批次内和批次间的变异性分别小于 5%和 10%。Choi 等建立了基于分子印记聚合物技术的表面等离子共振传感器检测 ZEA 的方法，对 ZEA 的检出限为0.3 ng/g，空白玉米样品中添加
30ng/g 的 ZEA 时，检测回收率为 89%，该方法与 ELISA 方法的检测能力相当。Actis 等建立了基于离子纳米通道介导信号转导的非标记的生物传感器技术，并将该方法用于HT-2 毒素的检测，方法的灵敏度为 100 fg/mL，比传统的夹心免疫分析方法的灵敏度高。
4.5 免疫芯片
免疫芯片（Immunochip）也称抗体芯片，是将抗原与抗体的特异性结合反应与高密度集成电子芯片结合而产生的生物芯片检测技术。免疫芯片是一种特殊的蛋白质芯片，在芯片上固定针对待测靶标物的特异性抗原或抗体等蛋白质，将其与标记的对应配体-抗体或抗原进行免疫反应，再加入信号标记物质反应后除去未反应的组分，读取信号信息即可实现基于芯片的免疫检测，进而对靶标物进行定量分析。免疫芯片的显著特点是高通量，能够将几个、几十个或更高数量的抗原或抗体密集的排列在一起组成免疫芯片，还具有检测操作所
需样品量少、灵敏度高、稳定性好等特点，在疾病诊断、药物筛选、环境和农业监测等领域得到了广泛的应用。但是该技术在食品安全检测中应用起步较晚，目前，该技术在真菌毒素检测中的报道较少，检测靶标物的数量也较少。

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