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不期而遇的能力验证及实验过程分享

夏天的雪

2016/08/08

私聊

液相色谱（LC）

１　前言
报名参加仪器信息网主办的“草根能力比对之37期：果汁中的苯甲酸含量测定”的样品到了，同时年初报名参加的“酱油中山梨酸、苯甲酸测定”的能力验证样品也到货了，一天收到两份比对样品外加手头的一堆样品，小伙伴们又得忙开了，值得庆幸的是两份能力验证样品都需要测定苯甲酸而且样品前处理方法都差不多，两者实验并不是很冲突，可以一块解决。
接到样品，分别检查样品包装的完整性，保存条件、样品编号并仔细研读作业指导书等附属资料。

苯甲酸和山梨酸的检测是实验室的常规检测项目，酱油和水果汁也是常见实验样品，于是先依据GB/T 23495-2009方法进行样品前处理，采用实验室现有的标准溶液和色谱条件进行测定，一方面是测算一下样品中待测组分的浓度以确定标准曲线范围；另一方面检查色谱条件或者样品前处理条件是否合适，是否会存在干扰或者分离不好的情况。
２　实验部分
实验方法参考GB/T23495-2009
２.１样品前处理
依据检测结果报告单的要求，分别采用称重和量取体积的方式对酱油和水果汁样品进行取样。称取约2.5g酱油样品（准确吸取2.０mL水果汁样品）于25mL容量瓶中，分别加入2mL亚铁氰化钾（0.25mol/L）和2mL乙酸锌（1.0mol/L），摇匀，加水定容至刻度后转移至50mL离心管中，4000r/min离心5min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后进样分析。

２.２仪器分析条件
色谱柱：Ultimate XB-C18 (250mm×4.6mm, 5μm)；流动相：甲醇：乙酸铵（0.20mol/L）=5：95；流速：1.0mL/min；进样体积：10μL；柱温：30℃；检测波长：230nm

２.３色谱条件优化
测试结果表明，水果汁样品干扰较少，样品中苯甲酸的浓度约为110mg/L；酱油样品较为复杂，在待测组分苯甲酸附近有干扰峰存在，采用原来的色谱条件进行测试时苯甲酸与干扰组分不能完全分离，从而影响苯甲酸的积分，最终会影响定量结果，因此需要先优化色谱条件，待组分完全分离后再定量。优化色谱条件，从简单的开始做起，先改变一下流动相比例，将甲醇和乙酸铵的比例改为2：98，重新进样并检查各组分保留时间的变化。在反相色谱中，各组分之间由于物理性质和或化学性能的差异，改变流动相中有机相比例适当调节流动相的极性通常能够影响各组分的保留时间，从而引起组分的分离，当甲醇和乙酸铵的比例改为2：98时，各组分的保留时间均延后，苯甲酸、山梨酸与干扰组分完全分离，因此决定采用该比例的流动相进行测定，在保证分离度的前提下牺牲点做样时间。由于水果汁中苯甲酸附近不存在杂质干扰问题，改变色谱条件也不会影响其测定，因此决定采用相同的色谱条件进行两组比对样品的测定，这样可以避免重复测定苯甲酸的标准曲线。计算得到酱油样品中苯甲酸的浓度约为0.6~0.8g/kg，山梨酸的浓度约为0.2~0.3g/kg。

２.４水果汁样品前处理条件优化
观察水果汁样品较为澄清透明，色谱图中也无明显的干扰组分，于是决定尝试采用直接进样和稀释后进样（不加沉淀剂）的方式对水果汁样品进行测试（上机前均需过0.22μm滤膜），测定结果如下：

直接进样时，水果汁样品中苯甲酸的浓度不是很高，在色谱柱的耐受范围内，没有出现拖尾、平头峰等异常情况，峰型尚可，也无杂质干扰，因此决定采用直接进样的方式对水果汁比对样品进行测试，减少取样、稀释过程的误差。酱油样品中色素和杂质较多，直接或稀释后进样可能会导致色谱柱污染，筛板或者在线过滤器堵塞等故障，因此仍然采用原先方法进行样品前处理。
２.５方法回收率测试

在样品前处理方法和色谱条件确定之后，考察方法的回收率。称取2.5g左右酱油样品，往样品中加入一定量的苯甲酸和山梨酸的混合标准溶液并按照上述方法前处理后进行测试；同时准确吸取2mL水果汁样品，往样品中加入一定量的苯甲酸标准溶液稀释到25mL后进行测试，考察方法的回收率，结果表明，酱油样品中苯甲酸和山梨酸的回收率分别为96.74%和100.98%，水果汁样品中苯甲酸的回收率为99.68% 。

２.６　仪器重复性和精密度测试
分别对标准溶液、酱油样品、水果汁样品进行重复测定5次，考察仪器的重复性和精密度。结果表明，仪器具有很好的重复性，标准溶液和样品中的苯甲酸、山梨酸的保留时间和峰面积的RSD都小于1%。

２.７　标准曲线及线性相关性
以上测定过程中使用的标准溶液均是由实验室之前配制的标准储备液稀释而来，虽然是按照规定条件进行保存，但是面对能力验证还是需要格外谨慎的，防止在保存过程中浓度发生改变，于是决定重新配制标准溶液。另外此次草根比对提供了苯甲酸固体标准品，实验室储备的是液体的标准溶液，实验之前先比较两者浓度的准确性是否一致。比较方法如下：
先将固体标准品配制成浓度为１000μg／mL的标准储备液，然后与实验室储备的液体标准溶液稀释到相同的、合适的浓度进行测定，比较两者的峰面积，结果显示两者的结果非常相近，表明两者的浓度是一致的，任选其一都不会影响实验结果。在确保前处理方法具有较好回收率和仪器稳定的情况下，按照上述色谱条件对新配的系列标准溶液重新进行测定并绘制标准曲线。苯甲酸和山梨酸的线性相关系数(R²)分别为0.99968和0.99969。

经过上述一系列的前期测试，在验证了方法的可行性和仪器的稳定性后，重新按照检测结果报告单要求（酱油样品为2个平行，水果汁样品为8平行）进行样品前处理并测试，测试完成后计算结果、按要求填写检测结果报告单、签字盖章并上交结果，到此能力验证才告一段落。
3 小结
（1）同为液体样品，能力验证提供的样品密封性较好，在瓶口多了一层封口膜，草根比对提供的样品瓶中没有封口膜，容易造成样品的滴漏；

（2）能力验证提供的样品比较充裕，草根比对提供的样品量较少，而且要求8个平行，几经折腾样品量已经消耗殆尽；
（3）草根比对在提供样品的同时提供了苯甲酸标准品，实验室不会因为没有标准品而措手不及。同时采用相同的标准品测试样品可以减少外界因素的影响，可以更多的考察操作过程和仪器的准确性。
（4）从酱油样品测定的色谱条件优化过程可以看出，改变流动相中有机相的比例不仅会改变个组分的保留时间，同时各组分间的出峰顺序也可能发生改变，例如苯甲酸与其干扰物的出峰顺序发生了变化；
（5）本次实验过程中水果汁样品尝试了稀释进样和直接进样的方式进行测定，该方法不可轻易尝试，需要依据样品状况而定，例如酱油样品中色素和杂质组分较多，采用上述方法可能会造成色谱柱污染，筛板堵塞等故障。
（6）能力验证样品在测试前需要仔细阅读作业指导书和检测结果报告单，了解样品提供者对测试方法、测试结果和完成日期的要求。
以上是个人的一点心得和实验小结，欢迎各位提出宝贵意见！

附件：

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