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利用有色溶液进行酶标仪期间核查的可行性分析

栀子花开

2016/09/14

私聊

食品常规理化分析

利用有色溶液进行酶标仪期间核查的可行性分析

本实验所用甲基橙、伊文斯蓝等试剂系杭州纽蓝科技有限公司惠赠，在此谨表谢意。
1酶标仪定义
酶标仪又称酶标分析仪，是对酶联免疫吸附试验（enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA）实验结果进行读取的专业精密光学仪器。酶标仪广泛应用于临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学中。
2期间核查相关规定
《实验室资质认定评审准则》5.4.8及ISO/IEC17025均规定：当需要利用期间核查以保持设备校准状态的可信度时，应按照规定的程序进行。
一般情况下，期间核查的方法，遵循该仪器的检定规程，只是检测项目上略有简化。
3酶标仪检定规程及其缺陷
JJG861-2007《酶标分析仪检定规程》是国内目前在用的酶标仪检定规程，对酶标仪的首次检定、后续检定和期间核查作了规定。依据该检定规程，检定或期间核查时须将嵌入标准中性滤光片的酶标板放入酶标仪进行读数。
该方法使用的中性滤光片每套4片（吸光度标称值分别为0.2、0.5、1.0、1.5），价格昂贵，且需定期检定、妥善保管，不易在基层实验室普及，也极不经济。
4前人的探索及不足
针对中性滤光片不易普及的现状，有学者探讨应用重铬酸钾的稀硫酸溶液对酶标仪性能进行检测，原因是该物质极其稳定，且颜色与ELISA方法常用的试剂盒（检测波长450 nm）最终反应颜色一致。但存在两个问题：一是应用有色溶液进行梯度稀释后，吸光度值（OD值）是否与有色溶液的浓度呈严格的线性关系？二是绝大多数文献只涉及检测波长450nm的核查，而对常用的检测波长490nm、630nm少有涉及。
5本文目的
据此，根据对酶标仪的长期使用，结合文献资料，对利用有色溶液核查常用的检测波长450nm、490nm、630nm的可行性进行分析。
6环境条件
温度25℃，湿度68%RH，无强光直射，无振动干扰，无噪声干扰，无磁场干扰，无电场干扰，无强气流影响，周围无易燃、易爆和腐蚀性气体，符合JJG861-2007要求。
7主要仪器设备及器材
7.1酶标仪：品牌略去；
7.2电子天平：赛多利斯BT125D，分度值0.01mg；
7.3移液器：Thermo单道可调移液器，(100~1000)μL，分度值5μL；
7.4移液器：Thermo单道可调移液器，(20~200)μL，分度值1μL；
7.5酶标板：COSTAR9018，96孔U型。
8试剂
8.1重铬酸钾：分析纯，含量不少于99.8%，上海试剂一厂；
8.2甲基橙：分析纯，沈阳市试剂三厂；
8.3伊文斯蓝：Sigma分装，含量>80%；
8.4浓硫酸：分析纯，浙江中星化工试剂有限公司，含量95%~98%；
8.5纯水：自制；
8.6硫酸溶液（0.05 mol/L）：取2.7 mL浓硫酸，缓缓注入纯水中，冷却，摇匀；
8.7重铬酸钾溶液（5000 ppm）：称取0.5g重铬酸钾，溶于100 mL 0.05 mol/L硫酸溶液中，摇匀，标记为A0（5000 ppm）。以A0为原液，用0.05 mol/L硫酸溶液作倍比稀释，分别得到2500 ppm、1250 ppm、625 ppm、312 ppm、156 ppm、78 ppm、39 ppm，标记为A1~A7；
8.8甲基橙溶液：称取0.1g甲基橙，溶于100 mL纯水中，摇匀，标记为B0（1000 ppm）。以B0为原液，用纯水作倍比稀释，分别得到500 ppm、250 ppm、125 ppm、62 ppm、31 ppm、16 ppm、8 ppm、4 ppm、2 ppm、1 ppm，标记为B1~B10；
8.9伊文斯蓝溶液：称取0.1g伊文斯蓝，溶于100 mL纯水中，摇匀，标记为C0（1000 ppm）。以C0为原液，用纯水作倍比稀释，分别得到500 ppm、250 ppm、125 ppm、62 ppm、31 ppm、16 ppm、8 ppm、4 ppm、2 ppm、1 ppm，标记为C1~C10。
9测试及结果
按照下列顺序向酶标板各孔加入一定量的有色溶液：

B10

C10

用酶标仪在450 nm、490 nm、630 nm分别进行测试，结果如下（为方便行文，下表将1~4列于450nm、5~8列于490 nm、9~12列于630 nm测试的结果组合在一张表内）：

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	2.824	2.903	2.927	2.706	2.908	2.899	2.975	2.958	2.793	2.807	2.803	2.839
B	1.706	1.713	1.713	1.665	1.843	1.850	1.805	1.837	1.617	1.614	1.614	1.609
C	0.849	0.865	0.867	0.844	0.949	0.945	0.928	0.951	0.821	0.816	0.816	0.820
D	0.438	0.445	0.440	0.431	0.480	0.475	0.487	0.490	0.426	0.419	0.420	0.421
E	0.230	0.231	0.231	0.227	0.256	0.262	0.261	0.260	0.221	0.221	0.217	0.221
F	0.131	0.131	0.131	0.132	0.144	0.144	0.145	0.145	0.124	0.125	0.121	0.121
G	0.086	0.084	0.082	0.079	0.087	0.090	0.088	0.088	0.077	0.076	0.075	0.075
H	0.057	0.061	0.057	0.056	0.059	0.059	0.059	0.059	0.050	0.051	0.051	0.051

10分析
10.1重铬酸钾溶液测试结果与浓度的关系

	A0	A1	A2	A3	A4	A5	A6	A7
浓度ppm	5000	2500	1250	625	312	156	78	39
OD均值	2.840	1.699	0.856	0.439	0.230	0.131	0.083	0.058
CV%	3.51	1.36	1.34	1.32	0.82	0.38	3.61	3.84

10.2重铬酸钾溶液浓度与吸光度值关系曲线

10.3甲基橙溶液测试结果与浓度的关系

	B3	B4	B5	B6	B7	B8	B9	B10
浓度ppm	125	62	31	16	8	4	2	1
OD均值	2.935	1.834	0.943	0.483	0.260	0.145	0.088	0.059
CV%	1.27	1.08	1.11	1.40	1.01	0.40	1.43	0.00

10.4甲基橙溶液浓度与吸光度值关系曲线

10.5伊文斯蓝溶液测试结果与浓度的关系

	C3	C4	C5	C6	C7	C8	C9	C10
浓度ppm	125	62	31	16	8	4	2	1
OD均值	2.811	1.614	0.818	0.422	0.220	0.123	0.076	0.051
CV%	0.71	0.21	0.32	0.74	0.91	1.68	1.26	0.99

10.6伊文斯蓝溶液浓度与吸光度值关系曲线

10.7各种有色溶液标准曲线回归方程与相关系数

	回归方程	相关系数
重铬酸钾溶液	y=0.00066769x+0.0262	0.9999
甲基橙溶液	y=0.028873x+0.0329	1.0000
伊文斯蓝溶液	y=0.025420x+0.0243	1.0000

11结论
酶标仪的吸光度值与重铬酸钾、甲基橙、伊文斯蓝等有色溶液的浓度呈线性关系，且相关系数极好，符合郎伯-比耳定律。每一浓度的重复测量，其变异系数（CV%）也较小，可以用于酶标仪的期间核查。
12讨论
12.1本研究是基于郎伯-比尔定律开展的。该定律认为：光被透明介质吸收的比例与入射光的强度无关；在光程上每等厚层介质吸收相同比例值的光。数学表达式为：A＝abc，其中A为物质的吸光度，a为物质的吸收系数，b为光路长度，c为物质的浓度。对于某种物质来说，其吸收系数a为一个固定值；对于酶标板来说，加入固定量的液体，基本上可以认为其光路长度是一个固定值；那么随着物质浓度的变化，吸光度也应该呈线性变化。本实验充分证实了这一点。
12.2基于本研究得出的吸光度值与物质浓度呈线性变化，以及相关系数极好等结果，可以作出这样的结论：配制某一固定OD值如用于核查的OD值为0.2、0.5、1.0、1.5的有色溶液，在确定光路长度的情况下，只需根据回归方程计算出物质的浓度，并利用母液进行适当稀释即可。对于基层实验室来说，可以充分利用现有条件及此结论，对酶标仪进行期间核查。
12.3限于时间，未对实验室中用到的有色溶液的OD值进行定值，也未对有色溶液的稳定性予以核实。此项工作有待下一步进行验证。
12.4细心的读者可能已经发现，文中三种溶液的检测结果与标准曲线并未完全一致，A0、B3、C3并未在标准曲线中予以绘制。此中原因涉及到另一个话题《利用有色溶液验证酶标仪的线性指标》，敬请期待。

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zyl3367898

第1楼2016/10/04

应助达人

很好的原创，都像楼主这样做期间核查，仪器有什么问题都可查出来。

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栀子花开

第2楼2016/10/07

应助达人

哈哈，确实查出来一些问题，具体在另一篇原创
zyl3367898(zyl3367898)发表:很好的原创，都像楼主这样做期间核查，仪器有什么问题都可查出来。

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lccdcjyk

第3楼2016/10/07

像楼主这样做期间核查，仪器有什么问题都可查出来。

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p3173963

第4楼2016/12/28

您好，我们这里只有一台紫外分光光度计，想配制0.2,0.5,1.0,1.5的测试液做酶标仪的期间核查，想请问怎样来确定光路长度，使得在紫外风光光度计下配制的测试液可以用来酶标仪的期间核查？

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栀子花开

第5楼2016/12/28

应助达人

紫外分光光度计用5mm光程测量，酶标仪测试时查看酶标板参数，使得光程也是5mm即可，我用的酶标板是142微升溶液刚好5mm高度
p3173963(p3173963) 发表:您好，我们这里只有一台紫外分光光度计，想配制0.2,0.5,1.0,1.5的测试液做酶标仪的期间核查，想请问怎样来确定光路长度，使得在紫外风光光度计下配制的测试液可以用来酶标仪的期间核查？

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p3173963

第6楼2016/12/29

老师，我可不可以用您上面的公式，把需要的吸光度值输入进去，得到需要的标准溶液的浓度，然后我来配制这个溶度的溶液当标准液？
栀子花开(qzxmsy) 发表: 紫外分光光度计用5mm光程测量，酶标仪测试时查看酶标板参数，使得光程也是5mm即可，我用的酶标板是142微升溶液刚好5mm高度

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栀子花开

第7楼2016/12/29

应助达人

如果不做吸光度示值误差检测，可以按公式计算配制，因其测量结果均为相对值。
若做吸光度示值误差检测，最好定值，因不同试剂可能吸光度值不同。
p3173963(p3173963) 发表: 老师，我可不可以用您上面的公式，把需要的吸光度值输入进去，得到需要的标准溶液的浓度，然后我来配制这个溶度的溶液当标准液？

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p3173963

第8楼2016/12/30

老师，我们要做吸光度示值误差，我们这边的紫外分光光度计是10mm光程的，且我们的酶标仪参数好像无法修改光程，我用标准曲线配置出来的溶液大约取160ul在450nm的波长下0.2,0.5,1.0,1.5基本上刚好符合，但是在405nm，620nm的波长下就不是标准值了，老师您有没有QQ或者微信，我想具体请教您下，麻烦您了！
栀子花开(qzxmsy) 发表: 如果不做吸光度示值误差检测，可以按公式计算配制，因其测量结果均为相对值。
若做吸光度示值误差检测，最好定值，因不同试剂可能吸光度值不同。

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栀子花开

第9楼2016/12/30

应助达人

这个问题分几个层次回答：
1.紫外分光光度计光程只有10mm也没有关系，你只需将结果按2倍系数换算即可。如紫外分光光度计10mm光程测量结果是0.2，那么在酶标仪上5mm光程的测量结果就应该是0.1；
2.为什么酶标仪光程取5mm，因为与紫外分光光度计的10mm光程测量结果换算起来比较容易。
酶标仪的光程也可以是其它数值，这个没关系。
酶标仪的光程如何测量或计算？测量很麻烦，一般直接按酶标板的参数进行计算。我使用的酶标板是COSTAR9018，查官网得到各个参数，根据参数算出溶液高度5mm时体积为142uL，所以取溶液142uL进行测量。如果使用其它酶标板，需要根据其参数调整溶液体积。
3.不同测量波长需要使用不同物质的溶液。450nm使用重铬酸钾溶液，620nm可以使用伊文斯蓝溶液，但其标准曲线应重新测量计算，因为我使用的是630nm，
对于405nm，本人因平时不使用该波长，因此未作研究。据文献报道，可用1mmo;/L对硝基苯酚的10mmol/L氢氧化钠溶液进行测定，你可以试试看。
p3173963(p3173963) 发表: 老师，我们要做吸光度示值误差，我们这边的紫外分光光度计是10mm光程的，且我们的酶标仪参数好像无法修改光程，我用标准曲线配置出来的溶液大约取160ul在450nm的波长下0.2,0.5,1.0,1.5基本上刚好符合，但是在405nm，620nm的波长下就不是标准值了，老师您有没有QQ或者微信，我想具体请教您下，麻烦您了！

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p3173963

第10楼2017/01/03

好的，谢谢老师，您太厉害了，敬佩！！
栀子花开(qzxmsy) 发表: 这个问题分几个层次回答：
1.紫外分光光度计光程只有10mm也没有关系，你只需将结果按2倍系数换算即可。如紫外分光光度计10mm光程测量结果是0.2，那么在酶标仪上5mm光程的测量结果就应该是0.1；
2.为什么酶标仪光程取5mm，因为与紫外分光光度计的10mm光程测量结果换算起来比较容易。
酶标仪的光程也可以是其它数值，这个没关系。
酶标仪的光程如何测量或计算？测量很麻烦，一般直接按酶标板的参数进行计算。我使用的酶标板是COSTAR9018，查官网得到各个参数，根据参数算出溶液高度5mm时体积为142uL，所以取溶液142uL进行测量。如果使用其它酶标板，需要根据其参数调整溶液体积。
3.不同测量波长需要使用不同物质的溶液。450nm使用重铬酸钾溶液，620nm可以使用伊文斯蓝溶液，但其标准曲线应重新测量计算，因为我使用的是630nm，
对于405nm，本人因平时不使用该波长，因此未作研究。据文献报道，可用1mmo;/L对硝基苯酚的10mmol/L氢氧化钠溶液进行测定，你可以试试看。