毛细管色谱柱的一生：从选用到报废的那些事儿

ghsunmer

2016/09/22

私聊

气相色谱（GC）

毛细管色谱柱是目前气相色谱中用到最多的色谱柱，可以说是气相色谱分离的核心，今天就和大家说说这一根毛细管色谱柱从选用、安装到保养维护乃至更换的那些事儿。看看一根毛细管色谱柱的一生都经历了什么，我们如何做能延长它的寿命呢？
自从1957年高雷(M.J.E.Golay) 开创了开管柱气相色谱法(Open-Tubular ColumnChromatography)之后，毛细管柱成为近年来发展极为迅速的一个领域，它的高效分离能力使它能够广泛应用于许多分析问题，是目前分离、分析复杂有机化合物的重要工具。毛细管柱的应用也在我国逐渐普及，许多新制定的国家、行业标准也都采用毛细管柱。毛细管柱是今后色谱分析的发展方向。

分析时，选择最佳的毛细管柱可能是一件非常困难的任务。虽然没有色谱柱选择的简易技巧、捷径、窍门或秘诀，但却有些指南和概念来简化此过程。
一根色谱柱的规格描述包括其固定相的种类和内外部尺寸（柱内径、长度和膜厚等）。不同规格的色谱柱，对样品的分离结果影响也不尽相同，如样品分离的洗脱顺序、保留时间、分离度和峰形/峰高等。另外，在实际分析应用中，色谱柱的性能指标，如惰性、塔板数和柱流失率等，同样会严重影响到样品的分离效果。
1、毛细管柱的种类

一般将毛细管柱分为四种类型：壁涂开管柱（WCOT）、载体涂渍开管柱（SCOT）、交联毛细管柱(CLOT）和多孔层开管柱（PLOT）。经典的毛细管柱为壁涂开管柱(WCOT——WallCoated Open Tubular Column)，管内经预处理后将固定液直接涂渍在内壁上。因其制备难、柱子的重复性差、内表面小、涂渍量小和相比β值大，将导致有效塔板数和实际分离能力不高，且热稳定性也较差，已很少使用。
多孔层壁涂柱（PLOT——PorousLayer Open Tubular Column）：内壁上仅涂一层多孔性吸附剂微粒，是毛细管气固色谱柱。
载体壁涂柱（SCOT——SupportCoated Open Tubular Column）：内壁上先涂一层载体，载体上再涂固定液。固定液膜可以较厚，柱容量也较大。必须注意，以上两种柱子中的载体只是涂布于毛细管柱的壁上，而非充满整根柱子。
交联毛细管柱(CLOT——Cross-LinkedOpen Tubular Column)：涂好固定液后再用偶联剂交联键合，柱子性能有很大改善，能耐高温，抗水、抗溶剂。
其中PLOT柱主要用于永久气体和低分子量有机化合物的分离；SCOT柱所用固定液的量大一些，故柱容量大一些，但由于制备技术复杂，应用也不太普遍。毛细管GC中的主力军是CLOT，其柱材料大多用熔融石英，即所谓弹性石英柱。
2、毛细管气相色谱柱的选择

a. 固定相的选择原则和方法
理论上讲，选择固定相首选遵循相似性原则，即：用非极性固定相分析非极性物质，用极性固定相分析极性物质，用含芳香基团的固定相分析芳香族化合物。在填充柱时代，这个想法是非常正确的，因为那个时候，分离度是首先需要把握的关键因素，分不开，就没办法想其它。它的理由在于塔板理论的推论，即：组分在固定相中有越大的溶解度差异，就会产生越大的分离度。
但是在毛细管色谱时代，分离度不再始终是分析的首选问题。毛细管具有几十万块塔板，如此大的柱效率，以至于不再需要充分考虑分离问题了。这个时候，样品兼容性、使用温度、稳定性、柱流失情况等，都可能成为选择的主要理由。
例如分析甲醇乙醇丙醇等低级醇类，正常应选择wax类高极性色谱柱。但是在杂质较少的情况下，选择DB-1这样的非极性柱具有更高的灵活性和使用寿命。具体选择
要依据以下规则：

i.因为非极性毛细管柱具有明显的稳定性、高使用温度、良好的色谱峰形等有利因素，因此易分离物质应首先选用极性小的色谱柱。
ii.分析氢键型物质用氢键型PEG柱更佳。
iii.轻烃或永久气体用PLOT柱更佳。
iv.高苯基固定相对芳香族物质保留能力更强。但是分析二甲苯等芳烃异构体，首选Wax类强极性色谱柱。
在过去的几十年中，所有的GC应用中，非极性色谱柱的使用率高于中等极性柱和极性柱。一般来说，非极性柱，如HP-5MS柱，可应用与于50%以上的分析。而极性或中等极性柱，如PEG柱，大概适用于25%的分析应用中。通常，我们会先选择非极性色谱柱，而极性色谱柱会选择性的用于比较简单的样品（较少种类化合物组成的样品）。

在选择适用的固定相时，分析设备和分析条件也是需要参考的指标。如检测器的种类、载气和进样体积等。
如果我们不考虑对样品选择性和检测灵敏度的影响，那么就使用检测器低响应固定相的色谱柱。比如说含氰基的固定相，像1301、1701、624等这样的色谱柱就尽量不要与NPD（氮磷检测器）连用。对于超低流失的固定相，如-1MS或-5MS的柱子，因为它们可以保证最低的检测基线和噪声水平，所以在做低或超低检测限样品时，超低流失色谱柱是最好的选择。如果我们使用的载气不纯，或是设备中有气体泄漏，这样的问题无法解决或无法及时解决，为了不使柱固定相过早的被破坏，高温适用固定相的色谱柱是相对好的选择。
另外，除非方法需要，我们尽量选择键合固定相的色谱柱，对比非键合相和非交联相色谱柱，交联键合固定相色谱柱对样品种类和进样体积的耐受力更强，柱性能下降的最慢。
在做应用方法确证时，我们可同时使用非极性柱和极性柱，对色谱峰鉴定或分离结果进行确证。通常我们做农药分析方法确证时，选用-5MS和 -1701/-35色谱柱；做残留溶剂分析方法确证时，选用-5MS和-624/-VMS色谱柱；做醇类或FAME分析方法确证时，选用PEG和含氰基固定相色谱柱；做汽油中氧化物分析方法确证时，选用-1和PEG色谱柱。
b. 色谱柱内径的选择

标准色谱柱内径（ID）尺寸为0.2mm、0.25mm、0.32mm和0.53mm。少数方法会使用到0.1mm和0.8mm内径的柱子。0.25mm是最常用的色谱柱内径尺寸，而0.53mm的色谱柱通常是替代填充柱用于大体积进样的方法应用。
色谱柱内径的大小对分离效果的影响是明显的。越细的色谱柱，其塔板数就越高，柱效就越高，但同时样品承载容量越小，进样体积就需要减少。但内径越小，通常意味着柱容量的减小，在分析低含量组分时，对检测器灵敏度和进样口分流能力的要求越高。因此在选择内径的时候，首先考虑的是样品分析难点，是在于分离还是检测。对于分离困难的样品，首选较小口径的色谱柱；对于含量过低检测困难的样品，首选较大口径的色谱柱。在容易分离的情况下，一般选择小口径毛细管柱可以缩短柱长，减小分析时间。
c. 色谱柱长度

色谱柱的长短直接影响到保留时间和分离效率。实验室应用的色谱柱长多为5m、7.5m、10m、12.5m、15m、25m、30m、50m、60m、75m、100m和105m等。最常见的色谱柱长度是30m。
对于快速分析来说，除了选择适当的内径，柱长度也短许多（例如5～15mx 0.25mm）。只有这样，才有可能在最短的时间内，得到最佳的分离效果和分析结果。
如果方法需要改进提高分辨率，较长的色谱柱，如60m或100m，是理想的选择。分辨率与柱长的平方根成正比。需要注意的是，像一根60m长的色谱柱相对于30m的柱子，其分辨率提高近40%，但分析时间会成倍增长。
在挥发物的分析应用中，为了改善分离效果，常使用较长的柱型，如50m、60m和100m等。在气态样品和精细烃分析应用中，较长色谱柱的使用较为普遍。
更长的色谱柱会影响柱惰性、柱流失和柱效等多个方面。同时，需要更高的载气压力或更换载气的种类（如把氮气更换成氢气/氦气）。
d. 色谱柱膜厚

商品化色谱柱的膜厚规格一般是0.1μm、 0.15μm、 0.25μm、 0.5μm、 1.0μm、 1.5μm、 3μm、5μm等等。实验室中最常见的色谱柱膜厚为0.25μm、0.5μm和1μm。
膜厚主要影响两个指标：保留时间和样品负载能力。
另外，色谱柱适用温度范围、分析时间和分析结果的准确性和可靠性等也与膜厚有关。例如一根内径为0.25mm，膜厚为0.1μm的色谱柱可以达成快速分离的效果，甚至可以改进分辨率，降低色谱柱的流失，适用于更宽泛的温度范围等。膜厚会影响到色谱柱惰性，而这个指标在有些应用中是非常重要的。同时膜厚对色谱柱样品承载能力的影响也是很明显的。
0.25μm× 0.25mm、0.5μm × 0.32mm、1μm或1.5μm × 0.53mm规格的色谱柱在分离效果、保留性能、分辨率、惰性和柱流失等指标方面较为均衡，使用也较多。
膜厚与柱内径的关系体现在相比（β）上。相比β是色谱柱中气相容积和固定相容积之比，计算公式为β=r/2d，其中r为色谱柱半径，d为液膜厚度。相比是决定一个固定长度色谱柱中组分流出时间的决定性因素。如果有两根相同相比和固定相的色谱柱，内径不同，在相同的温度条件下，两根色谱柱的分离效果和保留性能相同或相似。
需要注意的是：相比只是决定保留时间的主要因素，但并不是决定理论塔板数（柱效率）的主要因素。决定柱容量（最小检出量）的主要因素是内径和膜厚，决定柱效率的是内径，决定保留时间的是相比。在综合平衡柱容量、柱效率、分析时间三方面因素的时候，需要注意相比的影响。
最后要强调的一点是，选择色谱柱是必须要看具体的分析任务。如果是做法规分析，则必须按有关法规的要求选择色谱柱。如一些产品的质量检验，尽管用毛细管柱可以得到更好的分析结果，且分离效率高、分析速度快，但若国家标准或行业标准规定用填充柱，那就应该用填充柱，否则分析结果不被法规所认可。当然，作为方法开发的研究，用毛细管柱常常是有利的。
3、新色谱柱的验收
新买的气相色谱柱到货后要进行验收，验收首先是对货物的外包装进行观察，如有破损，应直接拒绝接受，要求供应商重新发货。打开包装后，色谱柱如没有可见的断裂、破损，可在安装、老化后使用标准物质进行柱效测试。
新柱子都有说明书，说明书一般都附有质量检测报告，附谱图、条件、试样等，如果实验室备有相应的测试标准物质，可照其条件试验一下，计算塔板数、分离度等，与其报告相差不大即可。亦可依据自己的分析用途，用本实验室的实际条件进行样品分析，与实验室以前的正常柱子比较，保留时间、分离度、塔板数等是否正常即可判断。建议保留新柱子的测试图谱，以备以后柱效下降时对比参考。
4、色谱柱的安装
把毛细管柱安装在色谱仪上时，需要将其两端分别与进样口和检测器相连接。一般仪器所用的接头有两种，分别是内螺纹接头和外螺纹接头。原理都是用一个石墨密封垫，通过接头压紧而达到固定和密封的目的。
正确的安装请参考以下步骤：
a. 检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等，保证辅助气和检测器的用气畅通有效。如果以前做过较脏样品或活性较高的化合物，需要将进样口的衬管清洗或更换。
b. 先将密封垫套在柱头，此时应将柱头向下，避免密封垫碎屑进入柱管而造成堵塞。将石墨垫套在柱头后，应将柱头截去1～2cm。可用专门的柱切割器，也可用一个开安剖瓶的磁片，在柱头上轻轻地划一下，然后用手掰断。这样做可以保证柱端是整洁的，又避免了柱头污染物对分析的干扰，因为截去了穿过密封垫时可能进入柱头的污染物，或者运输过程中可能损坏的柱端。
将色谱柱连接于进样口上，色谱柱在进样口中插入深度根据所使用的GC仪器不同而定。正确合适的插入能最大地保证试验结果的重现性。通常来说，色谱柱的入口应保持在进样口的中下部，当进样针穿过隔垫完全插入进样口后,如果针尖与色谱柱入口相差1～2cm，这就是较为理想的状态。检测器一端则是柱出口尽量接近检测点（如FID的火焰），以避免死体积造成的柱外效应（具体的插入程度和方法参见所使用GC的使用手册）。避免用力弯曲挤压毛细管柱，并小心,不要让标记牌等有锋利边缘的物品与毛细柱接触摩擦，以防柱身断裂受损。
c.用手把连接螺母拧上，拧紧后（用手拧不动了）用扳手再多拧1/4-1/2圈，保证安装的密封程度。因为不紧密的安装，不仅会引起载气的泄漏，而且有可能对色谱柱造成永久损坏。为保证柱端伸出的长度准确，可在截去柱端后，先量好柱头伸出长度，然后用记号笔或改字液在接头下方的色谱柱上做记号，拧紧接头以后保证该记号正好位于柱头端面。这样就避免了拧紧过程中柱管移动可能造成的伸出长度不准确。
d. 接通载气
当色谱柱与进样口接好后，可参考表3.4，由柱长、柱内径等参数选取初始的柱前压，然后通载气，调节柱前压以得到合适的载气流速。
将色谱柱的出口端插入装有正己烷的样品瓶中，正常情况下，我们可以看见瓶中稳定持续的气泡。如果没有气泡，就要重新检查一下载气装置和流量控制器等是否正确设置，并检查一下整个气路有无泄漏。等所有问题解决后，将色谱柱出口从瓶中取出，保证柱端口无溶剂残留，再进行下一步的安装。
e. 将色谱柱连接于检测器上,其安装和注意的事项与色谱柱与进样口连接大致相同。如果在应用中系统所使用的是ECD或NPD等，那么在老化色谱柱时，应该将柱子与检测器断开，这样检测器可能会更快达到稳定。
f. 确定载气流量，再对色谱柱的安装进行检查。注意：如果不通入载气就对色谱柱进行加热，会快速且永久性的损坏色谱柱。
5、色谱柱的老化与老化效果检测
色谱柱安装和系统检漏工作完成后，就可以对色谱柱进行老化了。
a．老化的方法：
老化的方法通常是将色谱柱升至一恒定温度，通常为其温度上限。特殊情况下，可加热至最高使用温度之上约10～20℃左右，但是一定不能超过色谱柱的温度上限，那样极易损坏色谱柱。
当到达老化温度后，记录并观察基线。初始阶段基线应持续上升，在到达老化温度后5～10分钟开始下降，并且会持续30～90分钟。当到达一个固定的值后就会稳定下来。如果在2～3小时后基线仍无法稳定或在15～20分钟后仍无明显的下降趋势，那么有可能系统有泄漏或者污染。遇到这样的情况，应立即将柱温降到40℃以下，尽快的检查系统并解决相关的问题。如果还是继续的老化，不仅对色谱柱有损坏而且始终得不到正常稳定的基线。
另外，老化的时间也不宜过长，不然会降低色谱柱的使用寿命。一般来说，涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间长，而弱极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。
b. 设置确认载气流速
对于毛细管色谱柱，载气的种类首选高纯度氮气或氢气。载气的纯度最好大于99.995%，而其中的含氧量越少越好。如果您使用的是毛细管色谱柱，那么依照载气的平均线速度（cm/sec），而不是利用载气流量（mL/min）来对载气做出评价。因为柱效的计算采用的是载气的平均线速度。推荐平均线速度值：氮气：10～12cm/sec；氢气：20～25cm/sec。
在载气的管线中加入气体过滤装置不仅可以延长色谱柱寿命，而且很大程度的降低了背景噪音。建议最好安装一个高容量脱氧管和一个载气净化器。使用ECD系统时，最好能在其辅助气路中也安装一个脱氧管。
c.柱流失检测
在色谱柱老化过程结束后，利用程序升温作一次空白试验（不进样）。一般是以10℃/min从50℃升至最高使用温度，达到最高使用温度后保持10min。这样我们就会得到一张流失图。这些数值可能对今后作对比试验和实验问题的解决有帮助。
在空白试验的色谱图中，不应该有色谱峰出现。如果出现了色谱峰，通常可能是从进样口带来的污染物。如果在正常的使用状态下，色谱柱的性能开始下降，基线的信号值会增高。另外，如果在很低的温度下，基线信号值明显的大于初始值，那么有可能是色谱柱和GC系统有污染。

6、色谱柱的保存
色谱柱用进样垫将色谱柱的两端封住，并放回原包装。在安装时要将色谱柱的两端截去一部分，以确保没有进样垫的碎屑残留于柱中。
7、色谱柱的重新安装
色谱柱重新安装时,密封要注意：
a.安装位置(尺寸)要重现，否则引起峰灵敏度变化；
b.安装时防止碎渣进入色谱柱引起峰形拖尾；
c.不需要拧得太紧；
e.使用清洁的密封垫，避免用手接触密封垫，以防手上的油脂污染；
f.密封垫安装前，要仔细检查有无损伤，以防安装后，有问题时不易拆除；
g.对那些不宜重复使用，如石墨密封垫，重新安装柱时要注意及时更换。
8、什么时候该更换色谱柱
分离度是考察一根色谱柱分离具体样品的好坏程度的指标。色谱的核心任务就是为了使每个峰完成分离，得到有合理峰宽的色谱峰，以便获得较低的检测限。然而，塔板数对分离度的影响仅仅是平方根的关系，当一根色谱柱的塔板数下降50%，分离度仅下降7%。
其实，大多数用户仅仅使用色谱柱塔板数的一小部分。例如，对一支新的150mm×4.6mm，5mm粒径的色谱柱来讲，厂家测试报告上的塔板数为14，000。使用下面的公式可以估算一支色谱柱的塔板数：N=3000L/Dp
L是色谱柱的柱长，以厘米为单位；Dp是填料的粒径，以微米为单位。
一支150mm×4.6mm，5mm粒径的色谱柱的柱效大约为9000，比厂家测试数据低30%。在实际的工作中，大多数色谱方法仅仅需要这些塔板数的一半，可见，色谱柱的塔板数不是分离中最重要的参数。
较好的方法是使用压力、分离度和峰形的混合指标来考察一根色谱柱的状态。
压力的测量是最容易的，通常我们确定的色谱方法要满足以下的要求：用新柱子时柱压不高于2500psi，在任何情况下压力都不超过3000psi。有统计表明，超过60%的色谱柱损坏是由于压力过高的原因。
分离度是考察色谱柱的一个非常重要的指标，只要两个组分可以获得基线分离，对该分析物的定量就不会有什么问题。对于高斯峰来讲，1.5的分离度即可得到基线分离；若分离度在1.7至2.0之间则更好。若峰拖尾严重则需要更高的分离度。使用分离度作为色谱柱的评价指标的好处在于我们可以直观地看到相邻的峰的分离情况。
另外一个考察色谱柱质量的标准是峰形拖尾情况，厂家测试报告的峰形都非常漂亮，但这并不代表该色谱柱分析实际样品的情况。
通常，在开发分析方法的过程中，一般会试验几根色谱柱，分析足够多的实际样品，就知道当分离变差时是什么样的情况。在开始时可使用一个宽的范围；如果在开始时紧缩系统适用性要求，在方法认证后再放宽这个要求，是很困难的。在分析实际样品之前进行系统适用性考察，以确保该色谱方法满足分析者可以接受的标准。

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