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人凝血因子Ⅷ酸沉淀过程分析和近红外定量模型的建立

qindong413

2016/09/29

私聊

生物制药

摘要：目的 对人凝血因子Ⅷ酸沉淀过程效价和总蛋白建立近红外模型，实现效价和总蛋白的快速检测，并以此确定酸沉终点。方法实验室模拟人凝血因子Ⅷ酸沉淀过程，对不同酸沉程度下的效价和总蛋白进行测定，同时采集近红外光谱，建立模型。结果酸沉淀过程中FⅧ比活性达到最高时的pH值并不固定，在6.1-6.5范围内波动，所以将固定的pH值作为酸沉淀的终点并不能达到最佳的效果。结论建立的人凝血因子Ⅷ酸沉过程中效价和总蛋白模型，固定加酸法不能准确判断酸沉最佳终点，所建立的近红外分析模型为在线实时监控溶解液中的FⅧ比活性提供参考方案。

关键词：近红外光谱分析技术人凝血因子Ⅷ 酸沉效价总蛋白

人凝血因子Ⅷ（coagulationfactor Ⅷ，FⅧ）是治疗甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状等的不可或缺的药品，而目前国内生产工艺相对落后，在国内29家血液制品企业中仅有4家有能力生产FⅧ，采用离子交换层析法从人血浆冷沉淀中分离纯化FⅧ的生产工艺，收率低（平均9%）、比活低。因此，针对生产现状，将现代过程分析与控制技术引入到FⅧ生产过程中的关键环节当中，增加对生产工艺过程的了解，有效控制工艺过程，提升FⅧ的收率及比活性。生产人凝血因子Ⅷ以人血浆的冷沉淀为原料，一般用含肝素钠的溶解液溶解，溶解液pH为7.2±0.1。溶解完全后依据不同蛋白质的等电点不同，加0.05M的醋酸溶液进行酸沉淀，使以纤维蛋白原为主的大量杂蛋白沉淀出来，而FⅧ大部分保留在上清液中，从而大大提升溶液的FⅧ比活性。在生产中，酸沉淀终点的控制依据经验以溶液的pH值为参考，当溶液的pH值为6.3±0.1时加酸过程终止，此时上清液中的蛋白含量较低而FⅧ的活性损失较少，因此能够得到FⅧ比活性高的产品。但是单纯以pH值为控制参数的终点控制方法，不一定能够保证不同批次的酸沉淀过程都达到最理想的状态，本试验将对FⅧ的酸沉淀过程进行分析，以检验是否不同批次溶解液的FⅧ比活性在pH=6.3时都达到最高值，并试图找到与比活性直接相关的物料参数——蛋白质含量作为酸沉淀终点的控制标准，使溶解液中FⅧ的比活提升和活性损失达到更均衡的状态。同时，利用近红外光谱分析技术，建立溶解液蛋白含量的PLS定量分析模型，进行蛋白含量的实时监控，从而实现以新参数为指标的酸沉淀终点控制。
1 材料
1.1 试剂
冷沉淀溶解液（山东泰邦生物制品有限公司），批号分别为201435、201436、201437、201438、201439，每批留样200mL；BCA试剂盒（碧云天生物技术研究所）；凝血因子Ⅷ促凝活性检测试剂盒（成都协和生物技术中心）；醋酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；三蒸水。
1.2 仪器
Antaris II傅里叶变换近红外光谱仪（美国ThermoFhisher公司）；PB-10酸度计（德国sartorius公司）；BF300恒流泵（保定齐力恒流泵有限公司）；JB-3A型恒温磁力搅拌器（上海雷磁创益仪器仪表有限公司）；Legendmicro 17R离心机（美国ThermoFhisher公司）；TW12恒温水浴箱（德国Julabo公司）；3001-1890酶标仪（美国ThermoFhisher公司）。
2 方法
2.1 样品的制备
2.1.1 配制醋酸溶液
量取醋酸约3.0mL，加入适量蒸馏水中，然后加蒸馏水至1.0L，得到浓度约为0.05M的醋酸溶液，混匀后用0.22 μm膜过滤。
2.1.2 酸沉淀过程
参照实际生产过程，在实验室进行小试规模的酸沉淀过程。将超低温冻存的冷沉淀溶解液约100mL放至室温融化，缓慢倒入烧杯中，将烧杯置于低温水浴中，用酸度计监测溶解液的pH值和温度，然后以1mL/min的速度滴加配制好的醋酸溶液，边加边搅拌，使溶液的pH值由7.2左右降低至5.9左右，此过程中溶解液的温度由室温（25℃）均匀降低至15 ℃。重复进行此实验10次，每次实验过程之间保证相同的环境温度、水浴温度、醋酸浓度、加酸速度和搅拌速度。每次酸沉淀过程中pH值每变化0.1取样800μL，取样后立即进行离心（10000 rpm，5min），保留上清液作为样品，进行后面的光谱采集和蛋白含量及FⅧ效价的测定。
2.2 近红外光谱的采集
选择AntarisII光谱仪的透射模块进行上清液光谱的采集。选用4 mm光程的比色皿，加样量约为400μL，光谱扫描范围为10000-4000 cm^-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm^-1，以空气为参比进行采集，每隔1小时校正一次背景，测量环境为室温，湿度30%-50%。
2.3 FⅧ效价的测定
使用凝血因子Ⅷ促凝活性检验试剂盒对上清液中的FⅧ效价进行检测，试剂盒中包含正常凝血质控血浆、缺凝血因子Ⅷ血浆，APTT试剂b/a、稀释液、CaCl₂溶液，现用现配。
2.3.1 标准曲线的制作
除氯化钙溶液在37℃水浴预热外，其余样品、试剂均置冰水浴中。
1）将正常凝血质控血浆用稀释液1作1/2、1/5、1/10、1/20、1/40、1/80倍比稀释，其对应FⅧ：C百分活性为500%、200%、100%、50%、25%、12.5%。
2）取某一稀释度正常凝血质控血浆0.1mL、缺凝血因子Ⅷ血浆0.1 mL、APTT试剂0.1mL于透明小试管，混匀后即置37℃水浴温浴10min。
3）迅速加入氯化钙溶液0.1mL，同时启动秒表，在水浴中以1-2次/秒的频率摇动小试管，当观察到凝固出现时，立刻停表记录凝固时间。
4）以不同稀释度正常凝血质控血浆FⅧ：C百分活性为X，对应的凝固时间（秒）为Y，按照统计学方法作直线回归方程，方程形式为Y=blog X+ a，即得标准曲线。
2.3.2 样品效价的测定
1）将上清液用稀释液1作1/100倍稀释，即取10µL样品液加稀释液990µL，以此代替标准曲线制作项中某一稀释度正常凝血质控血浆，按照同样方法测定凝固时间。
2）将样品凝固时间（秒）代入标准曲线方程，计算X值，即得样品FⅧ：C百分活性水平。
2.4 总蛋白含量的测定
样品上清液中总蛋白质的含量测定采用Bicinchoninicacid（BCA）法。BCA法是应用较为广泛的蛋白定量方法之一，其原理是在碱性条件下，蛋白质与Cu²⁺络合，使之还原成Cu¹⁺，Cu¹⁺可与BCA形成稳定的蓝紫色复合物，复合物在561nm处有强吸收且吸收值与蛋白浓度成正比。BCA法原理与Lowery法相似，但是灵敏度高，操作简单，稳定性好，干扰物质对其影响也较小。
2.4.1 配制工作溶液
将BCA试剂盒铜试剂按照体积比50:1混合，得到嫩绿色的标准工作试剂（WorkingReagent，WR），WR在室温条件下十分稳定。
2.4.2 配制标准蛋白溶液
配制0.5 mg/mL的BSA蛋白溶液，在96孔板中用PBS缓冲液对BSA溶液进行稀释，得到相同体积的BSA标准溶液0、25、50、100、200、300、400、500μg/mL，每个浓度的BSA标准溶液再各加200μL WR。具体稀释方案如表1所示。
2.4.3 测定蛋白浓度
每个样品取2 μL置于96孔板中，加18μL PBS缓冲液，然后加200 μL WR，在37℃培养箱中放置30min。将反应温度冷却至室温，用酶标仪测定标准蛋白溶液和样品溶液在561 nm处的吸光度值，绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度。

表1 标准蛋白溶液和待测样品的加样量和比例

孔数	蛋白浓度（μg/mL）	标准或待测蛋白溶液体积（μL）	PBS缓冲液体积（μL）	WR体积（μL）
1	0	0	20	200
2	25	1	19	200
3	50	2	18	200
4	100	4	16	200
5	200	8	12	200
6	300	12	8	200
7	400	16	4	200
8	500	20	0	200
9	待测样品	2	18	200

2.5 数据处理
得到各样品的蛋白含量和FⅧ效价后，计算其比活性，对每次酸沉淀过程中总蛋白含量、FⅧ活性损失以及FⅧ的比活性随pH值变化的情况进行综合考察，验证以pH=6.3为沉淀终点的合理性，并探究更合理的终点控制参数。
采用PLS对上清液中的蛋白含量进行定量分析，首先将收集到的样品根据试验次数的不同随机划分为校正样品和验证样品，组成校正集和验证集；然后将测定的光谱数据和一级数据进行预处理，选择合适的化学计量学算法，将样品光谱信息和蛋白含量进行关联，建立校正模型；使用验证集光谱和校正模型计算验证集预测值，并与验证集参考值比对，评价模型的预测能力和有效性；根据评价结果决定模型能否使用或更新。
3 实验结果
3.1 FⅧ效价的测定
本研究共进行了10次FⅧ酸沉淀的小试过程，每次过程中取样12-14个，最终共获得样品138个。由于反应开始阶段FⅧ效价降低的趋势较为明显，这些样品的FⅧ效价多为间隔测量，而反应后半段FⅧ效价降低的趋势趋于平缓，对研究更有参考价值，这些样品的FⅧ效价逐一测量，最终得到108个样品的FⅧ效价值，如表2所示。

表2 样品的FⅧ效价（IU/mL）测定结果

编号批次	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
1	9.33	8.59	8.72	8.43	8.19	7.76	7.43	7.58	6.49	6.31	3.97	5.93	3.80	2.18
2		10.85	10.32	7.96	7.74	7.17	9.50	6.04	6.00	5.78	4.97	6.86	4.38	3.61
3	4.21	4.08	3.14	3.32	2.83	2.62	2.56	2.00	1.94	1.43
4	5.35	5.50	4.66	4.69	5.18	4.71	4.49	3.97	3.70	3.40
5	10.28	10.81	10.12	9.11	8.02	6.61	7.97	7.89	8.81	7.80
6	11.24	12.28	13.26	9.89	8.57	7.46	7.97	6.64	5.50	3.97
7	9.68	8.86	9.95	10.63	9.57	8.33	8.11	7.30	6.72	5.41
8	10.81	10.69	8.96	8.91	7.71	6.79	6.50	6.11	6.08	4.98
9	11.11	10.40	10.46	9.57	10.28	8.20	7.80	8.02	7.10	5.50
10	10.03	11.09	9.60	10.03	8.47	8.15	8.63	8.43	7.54	5.54

图1 样品的FⅧ效价变化趋势图

每次酸沉淀过程中溶解液FⅧ效价随pH值的变化情况如上图1所示。从图中可以看出，冷沉淀的溶解液初始pH值为7.2±0.1，随着滴加醋酸溶液，溶解液的pH值缓慢降低，一直到pH值为5.9±0.1时停止加酸，酸沉淀过程停止；由于留样批次和存放时间的不同，不同试验次数酸沉淀过程的溶解液初始FⅧ效价不尽相同，多数为10IU/mL左右，也有两次实验的溶解液初始FⅧ效价为4.2-5.3IU/mL，但是每次实验的溶解液FⅧ效价都随pH值的降低呈持续性下降的趋势，尽早结束加酸可以减少FⅧ活性的损失。

3.2 蛋白质浓度的测定
采用BCA法测定138个样品的总蛋白质含量，每次测定都重新建立标准曲线，保证每次建立的标准曲线的决定系数在0.99以上，以确保分析的准确性。最终测定的样品总蛋白含量结果如下表3所示。

表3 样品总蛋白含量（mg/mL）测定结果

编号批次	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
1	49.4	41.6	40	50.2	26.4	25.8	20.5	16.1	17.1	18.1	19.8	19.5	18.9	20.6
2	52.15	50.58	46.33	42.12	40.53	37.09	21.99	22.62	17.54	13.27	12.85	7.93	11.98	9.16
3	39.87	40.93	39.04	35.35	31.66	24.68	24.66	18.59	16.46	13.46	12.88	11.44	11.66	10.84
4	44.99	36.52	33.99	30.18	27.44	26.03	20.35	16.90	18.13	14.14	12.89	11.96
5	23.53	36.98	28.62	29.95	24.86	27.32	17.40	24.76	16.37	15.16	13.15	10.12	8.97	8.30
6	38.01	26.13	26.39	29.69	23.98	29.05	25.79	23.42	18.53	12.35	13.70	14.62	10.63	7.24
7	50.15	41.46	41.00	39.27	34.29	30.44	24.50	22.45	19.47	16.64	13.66	13.39	10.57	8.48
8	44.41	37.33	36.82	35.72	33.85	29.40	24.08	21.45	19.46	14.89	11.70	11.79	10.70	10.77
9	42.27	42.40	43.31	41.84	41.71	40.08	33.18	30.66	23.16	19.22	16.98	15.06	14.40	13.96
10	39.92	37.08	39.10	38.54	28.69	32.90	25.39	24.16	19.15	15.79	14.03	12.65	11.07	10.27

图2 样品总蛋白含量随pH变化趋势图

图2为酸沉淀过程中，样品的总蛋白质含量随pH值降低的变化趋势图，可以看出，不同试验次数的冷沉淀溶解液初始蛋白含量存在一定的差异，约40-50mg/mL范围内，随着醋酸溶液的添加，溶液的pH值降低，溶液中的蛋白质开始沉淀出来，在pH=6.6之前沉淀速度较快，而在pH到达6.4之后蛋白沉淀速度变慢，逐渐趋于平稳。所以，选择合适的酸沉淀终点，可以除去大量的杂蛋白，大大提高FⅧ产品的比活性，提高生产效益。
3.3 FⅧ比活性的变化情况
酸沉淀的主要目的是去除人纤维蛋白原为主的大量杂蛋白，提高FⅧ比活性。根据前面测量得到的样品FⅧ效价值和总蛋白含量值，可以计算出酸沉淀过程中溶解液的FⅧ比活性，如表4所示。

表4 样品的FⅧ比活性（IU/mg）结果

编号批次	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
1	0.19	0.21	0.22	0.17	0.31	0.30	0.36	0.47	0.38	0.35	0.20	0.30	0.20	0.11
2		0.21	0.22	0.19	0.19	0.19	0.43	0.27	0.34	0.44	0.39	0.86	0.37	0.39
3	0.11	0.10		0.09		0.13	0.11	0.14	0.16	0.15	0.15	0.13
4	0.12	0.15		0.15		0.18	0.25	0.28	0.25	0.28	0.29	0.28
5	0.24	0.29		0.34		0.33		0.32	0.40	0.53	0.60	0.87	0.87
6	0.30	0.47		0.45		0.34		0.37	0.40	0.65	0.48	0.38	0.37
7	0.19	0.21		0.25	0.31	0.39		0.43	0.49	0.53	0.50	0.51
8	0.24	0.29		0.25		0.30		0.36	0.35	0.44	0.52	0.52	0.47
9	0.26	0.25		0.25		0.24		0.34	0.35	0.41	0.47	0.47	0.38
10	0.25	0.30		0.25		0.30		0.35	0.43	0.55	0.60	0.60	0.50

酸沉淀过程中溶解液的FⅧ比活性随pH值变化的情况如图3所示。从图中可知，溶解液的初始FⅧ比活性较低，约为0.1-0.4IU/mg，随着pH值的降低，杂蛋白大量沉淀出来，FⅧ比活性会有一定程度的提升，当pH值降至6.1-6.5之间的某个值时，溶解液的FⅧ比活性将达到峰值，随后会随着pH值的继续减小而降低，每次酸沉淀过程中溶解液FⅧ比活性达到最高值时溶液的pH值列于表5。从表中可以发现，FⅧ比活性达到最高时的pH值并不固定，因此，将pH=6.3设定为反应终点无法满足要求，有必要寻找更加科学的终点判断方法。

图3 样品FⅧ比活性随pH值变化趋势图

表5 FⅧ比活性最高时的溶液pH值情况

批次	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
初始比活（IU/mg）	0.19	0.21	0.11	0.12	0.44	0.30	0.19	0.24	0.26	0.25
最高比活（IU/mg）	0.47	0.86	0.16	0.29	0.87	0.65	0.53	0.52	0.47	0.60
pH值	6.5	6.1	6.3	6.4	6.1	6.3	6.3	6.2	6.2	6.2

3.4 近红外定量模型的建立
实验证明，以溶解液中pH值的变化为指标控制酸沉淀的终点并不能保证得到最佳的FⅧ比活性，但是当前生产中对于FⅧ比活的测定并无快速准确的方法，离线分析方法耗时过长，无法满足快速分析、实时监测的要求，而近红外光谱分析技术很好地解决了这个问题，利用合适的近红外仪器和建立的PLS定量分析模型，可以在生产过程中实时监测溶解液中的FⅧ比活性，快速、准确，从而使这种新的终点控制方法成为现实。
3.4.1 样品的近红外光谱图
获得的138个样品中，有108个进行了FⅧ效价的测定，即有108个样品得到了FⅧ比活性的一级数据。这108个样品的近红外透射光谱如图4所示。

图4 酸沉淀过程中样品的近红外光谱图

3.4.2 划分校正集和验证集
校正集中的样品应包含使用该模型预测的未知样品中可能存在的所有化学成分，且校正集的化学成分浓度范围应覆盖使用该模型预测的未知样品中可能遇到的浓度范围。在整个变化范围内，样品的浓度是均匀分布的。同时验证集中的样品应包含使用模型分析的待测样品中可能存在的所有化学组成。验证集化学成分的浓度范围应覆盖该模型分析的待测样品中可能遇到的浓度范围，且均匀分布。将10次试验所收集到的样品，随机选取6次试验（第2、3、5、6、8、10次）的样品作为校正集样品，共64个，剩余4次试验的样品作为验证集样品，共44个。样品集的信息如表6所示，从表中可以看出，样品集的划分符合要求。

表6 样品集信息表

样品集	数量	最大值（IU/mg）	最小值（IU/mg）	平均值（IU/mg）	标准偏差
校正集	64	0.87	0.09	0.36	0.18
验证集	44	0.74	0.11	0.33	0.14

图5为校正集样品和验证集样品的主成分得分图，图中显示灰色点为校正集样品，红色点为验证集样品，可以发现，验证集样品较为均匀地分布在校正集样品之中，进一步说明了样品集划分的合理性。

图5 样品的主成分得分图

3.4.3 异常样品的识别
在校正过程中可能会检测到两类异常样品。第一类是高杠杆值样品，与校正集中其他样品相比，含有极端组成，光谱不具代表性，其光谱对用于建模的一个或多个光谱变量具有显著性贡献，对回归结果有强烈的影响，或者对至少一个回归系数起着相当重要的决定作用，对模型的稳健性有强烈的扰动作用，可用马氏距离或杠杆值等统计指标判断；第二类是预测值与参考值有显著性差异的样品，由一级数据测定误差较大或光谱测量误差较大等原因造成，对回归分析影响明显，一般用学生化残差等方法诊断。建立校正模型所用校正集样品的学生化残差——杠杆值图如下图6所示，横坐标为杠杆值，纵坐标为学生化残差值，纵向蓝色线段表示3LV/m值，LV为变量数，m为校正集样品数，对于线性校正方法，每个样品平均贡献了光谱变量的LV/m，对于杠杆值大于3LV/m的两个样品，其光谱对于其中一个光谱变量的确定及该变量对应的回归系数具有显著性贡献，应从校正集中剔除。图中未见学生化残差超过临界值的点，说明校正集样品的参考值与预测值之间没有显著性差异。

图6 学生化残差——杠杆值图

3.4.4 数据的预处理和模型的建立
在光谱测量过程中不可避免地会引入噪声和产生基线漂移，会对建立模型产生不利的影响。如图7所示，光谱数据未经任何预处理所建立的模型结果很差，线性低，预测误差高，所以应在模型建立前采用一种或多种预处理方法对光谱数据进行预处理，包括微分、平滑、中心化和标准化等。微分可以有效消除基线的漂移，放大信号差异，但同时也会放大噪声的信号，降低光谱的信噪比；平滑多与微分联用，可有效提高信噪比，但使用不当会降低分辨率；标准化可以赋予光谱中所有波长的变量相同的权重，可以凸显样品光谱的差异，适用于低浓度成分的建模分析。
首先采用一阶微分和SG平滑的预处理方法对光谱进行预处理，平滑窗口宽度的选择十分重要，窗口过窄则平滑效果不好，窗口过宽则会丢失过多有效信息。这里分别考察了当窗口宽度为11点、13点和15点时，处理后的校正集样品光谱所建立模型结果的好坏，如表7所示。从表中可以对比得出，SG平滑窗口的宽度为13点时模型线性最好，均方根误差最小，结果最优。一阶微分+SG13点平滑预处理后的光谱建模结果如图8所示，校正集样品拟合较好，但模型的预测能力较差，有必要对光谱数据进行标准化处理。图9所示为用经过一阶微分+SG13点平滑+Autoscale处理后的光谱所建立模型的结果，可以看到，模型不仅校正集样品拟合的很好，预测能力也非常好，R_c=0.9649，R_p=0.9229，RMSEC=0.0576，RMSEP=0.0493。

表7 不同窗口宽度平滑处理建模结果

预处理方法	R_c	RMSEC
一阶+SG11点	0.7915	0.1093
一阶+SG13点	0.9468	0.0576
一阶+SG15点	0.9289	0.0622

图7 未经预处理的光谱建模结果

图8 一阶微分+SG13点平滑后光谱建模结果

图9 一阶微分+SG13点平滑+Autoscale处理后光谱建模结果

3.4.5 预测值的精密度
所建立的校正模型的预测精密度通过重复测量光谱计算。随机选取验证集样品中的1-1号、4-7号和7-8号样品，每个样品重复测量6次，然后采用建立的模型通过采集光谱得到样品的预测值。通过计算每个样品预测值的平均值、标准偏差或相对标准偏差来表示预测的精密度，结果如表8所示。表中显示模型的预测精密度良好，相对标准偏差在6%以内，且FⅧ比活性值越高，预测的精密度越好，可以用此模型进行未知样品的预测。

表8 模型预测精密度结果

测量次数	比活性预测值（IU/mg）
测量次数	1-1号	4-7号	7-8号
1	0.21	0.28	0.49
2	0.23	0.26	0.51
3	0.22	0.27	0.48
4	0.23	0.30	0.49
5	0.20	0.28	0.47
6	0.21	0.29	0.50
平均值	0.22	0.28	0.49
标准偏差	0.012	0.014	0.014
相对标准偏差	5.6%	5.1%	2.9%

4 结论与讨论
本实验考察了人凝血因子Ⅷ生产过程中酸沉淀终点控制方法的合理性。酸沉淀是根据蛋白质等电点的不同，向人血浆冷沉淀溶解液中加入0.05M的醋酸，使以纤维蛋白原为主的大量杂蛋白沉淀出来，而大部分FⅧ得以保留在上清液中，从而提升FⅧ的比活性。当前酸沉淀终点的控制是依据产品开发时的小试结果和生产经验，在pH=6.3时停止加酸，通过多次试验证明，酸沉淀过程中FⅧ比活性达到最高时的pH值并不固定，在6.1-6.5范围内波动，所以将固定的pH值作为酸沉淀的终点并不能达到最佳的效果。以近红外光谱分析技术和化学计量学为基础的过程分析技术，可有效解决当前生产中离线分析费时费力的问题，使在线实时监控溶解液中的FⅧ比活性成为可能。
参考文献
国家药典委员会. 中华人民共和国药典（三部）.北京: 化学工业出版社,2010: 236-237.
倪道明. 血液制品. 北京: 人民卫生出版社,2013.
T Burnouf, M. Burnouf-Radosevich, J. J. Huart, etal. A Highly Purified Factor Ⅷ:cConcentrate Prepared from Cryoprecipitate by Ion-Exchange Chromatography .VoxSanguinis, 1991, 60(1): 8-15.

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