液质联用检测血清中的植物甾醇，血样如何处理？

应助达人

一般过SPE小柱或灵敏度够的话直接稀释大的倍数上机

你好。首先要从全血制备血清：采血至不含抗凝剂的采血管中，室温放置30-60分钟，3000g离心10分钟，取上清，保存至低温冰箱中（如-80度）。
其次对血清样品进行处理，生物样本处理方式有PPT, LLE, SPE等。建议从最基本PPT蛋白沉淀开始，甾醇类都具有一定的脂溶性，所以可以使用甲醇或乙腈（或50%甲醇或乙腈）作为沉淀剂进行提取，离心后，取上清，如果是正相色谱可直接进样，如果是反相色谱则用水复溶后再进样。若反相色谱响应不够，可将上清氮气吹干后再用水复溶后进样。如果效果不理想，再尝试液液萃取或固相萃取。

两种方案，一种是 加有机相 高速离心；不行的话，
就SPE固相萃取，氮吹挥干再溶解

对血清样品进行处理，生物样本处理方式基本上有PPT, LLE, SPE，另外再次基础上有衍生等方法。
可查阅下文献，我大致看了下，气相和液相方法都有，多数是反相色谱柱分离，可以选择用正己烷，乙酸乙酯，或者用50%甲醇，50%乙腈提取下对比下提取效率，选用效率高的试剂。

您好，非常感谢您的指点，血清中的甾醇类有部分是以酯化的形式存在的存在，还需要进行皂化。我的做法是，先用乙腈沉淀血清蛋白，然后进行皂化，之后用石油醚提取，离心后，取上清，将上清氮气吹干后再复溶进样，但效果不理想，用的是外标法，用同样的方法处理标准品，但处理之后的标准曲线，线性不太好。不知道是什么原因标准曲线线性一直不太好，跪求高手指点，我该从哪方面改进。

如果选择用石油醚提取，需要在提取前进行蛋白沉淀吗？

你好。
1. 如果测游离态的就不需要皂化；皂化后测的是总含量，建议先蛋白沉淀，后皂化，再吹干，复溶。
2. 不一定需要加上石油醚萃取这步，待测物在乙腈和石油醚中的溶解度有待考察，总之会降低提取回收率。
3. 线性不理想有很多原因会导致。建议考察低浓度点和高浓度点的提取回收率是否一致，若不一致，改变提取剂；考察待测物是否存在吸附作用，若有吸附，添加表面活性剂，吹干前加少量DMSO；考虑待测物可能与血清蛋白的Binding, 提取剂中可加少量的酸，如FA；最后，也可尝试APCI源，等等。

您好，谢谢您详细的解答。
您之前所说的，生物样本处理方式有PPT, LLE, SPE等。对血清皂化之后，然后用石油醚提取，是不是相当于是液液萃取了？那还需要进行蛋白沉淀这一步吗？因为，若用乙腈沉淀蛋白，乙腈会影响在甾醇类在石油醚中的溶解度，会降低提取回收率。请问可不可以把乙腈沉淀蛋白这一步去掉，先对血清皂化，石油醚提取，后氮气吹干复溶。之前没有尝试过这样，不知道这种方法可不可行。