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草木皆为剑 ——第39期草根比对小记（完结）

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2016/12/07

私聊

气相色谱（GC）

1、前言
本次比对内容是二硫化碳中7种苯系物（不包括异丙苯），体系简单、目标物稳定、浓度较高，因此是相对较为简单的。相关的标准方法较为成熟，主要是GC-FID法。根据上述情况可知，本次比对的关键在于苯系物的分离和定量的准确度。
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分离方面，传统使用的色谱柱是DNP-有机皂土混合填充柱，选择性较好，异构体分离度可达1.5甚至更高，但缺点是柱效低，体系基体复杂时抗干扰能力较弱。近年来使用聚乙二醇毛细管柱分离C8芳烃异构体较多，虽然PEG固定相的选择性并不算太好，但可以通过高柱效来弥补这一不足，分离度也较好。另外还有环糊精毛细管柱的报道，虽然选择性明显优于聚乙二醇固定相，但是还不普及。
定量准确度方面，仪器稳定性、方法条件、标样制备、进样操作等都有影响。仪器稳定性是基础条件，安捷伦的公认比较好，但实际上大部分国产仪器也是能够胜任这次的测试要求的，关键是维护得当。方法条件一般都是参照相关标准，只要能结合实际情况进行适当调整，一般也不会有问题。标样是一个关键问题，买有证标准溶液直接使用是最保险的，但是成本较高，所以经费不足的实验室都是自己制备标准溶液，可能出现的问题较多，是误差的重要来源。进样操作是误差的重要来源之一，有优质的自动进样器当然不存在这方面的问题，手动进样则难以保证，而手动进样误差的大小规律一般是：不分流比分流准、分流越大越不准，填充柱比毛细管柱准、口径越小越不准。
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目前国内很多检测实验室的设备条件都已经很好，安捷伦基本上成为标配，岛津沦为入门级，要实现上述两方面的要求是比较简单的。但是，由于管理、经费、采购等多方面的原因，条件水平差得实验室仍然大量存在。于是也有很多实验人员经常抱怨条件太差做不出好的数据。所谓“工欲善其事必先利其器”，工具是进行生产劳动的基本要素之一。但是不妨思考一下：砍瓜切菜需要用倚天剑吗？手持屠龙刀就能有庖丁解牛的效果吗？

针对本次比对的内容，本实验室采用国产中低端的气相色谱仪和自制的填充柱、自行优化的方法条件、自行配置的标液、手动进样完成相关测试内容。
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2、实验部分

2.1 仪器
山东鲁南瑞虹SP7820气相色谱仪，配填充柱进样器和FID检测器。
自制填充柱，长3m、内径2mm、外径3mm，填料为80-100目CHROMOSORB G负载DNP（1.5%）+有机皂土（2.1%）。
国产氮氢空一体机。
赛多利斯天平（0.01mg），梅特勒移液枪（1mL），汉密尔顿注射器（50μL），国产微量进样针（10μL）。
安捷伦样品瓶，4mL、1.5mL。

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2.2 色谱条件
进样器150℃，检测器200℃，柱室80℃。载气为氢气，25mL/min。FID氢气20mL/min，FID补充气为氮气40mL/min，空气400mL/min。进样量为1.0μL。

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2.3 标样
以7种苯系物的分析纯试剂为标样（上海国药或阿拉丁试剂购买）。
向4mL样品瓶中准确移取4.000mL二硫化碳（色谱纯，阿拉丁试剂购买）。用微量注射器吸取标样约9μL，均用天平准确称量其质量，然后注入装有二硫化碳的4mL样品瓶中，重复操作，得到7种苯系物标准储备液，浓度均为2g/L。
取1.5mL样品瓶5个，均准确注入1.500mL二硫化碳，然后分别注入0.0、25.0、50.0、75.0、100.0μL苯系物标准储备液，得到标准序列。

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2.4 试样测定
试样安剖用乙醇擦拭干净后打开，倒入4mL样品瓶中待用。用10μL微量进样针准确进样1.0μL进行色谱测定。标样测定与待测样相同。
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3、结果
3.1 色谱图
按2.2所述实验条件获得的色谱图如下。
分离时间约12min，总柱效可达5000塔板以上，异构体分离度1.4~1.9，溶剂峰不干扰苯的峰。

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3.2 标样浓度

	浓度（mg/L）
	标1	标2	标3	标4	标5
苯	5.4	39.1	71.7	103.3	133.9
甲苯	0.0	32.1	63.2	93.2	122.4
乙苯	0.0	32.6	64.1	94.7	124.2
对二甲苯	0.0	32.4	63.7	94.1	123.5
间二甲苯	0.0	32.5	64.0	94.4	123.9
邻二甲苯	0.0	32.3	63.6	93.9	123.3
苯乙烯	0.0	30.7	60.4	89.1	117.0
注：溶剂中含有苯，本底值为5.4mg/L，所列浓度为配置值+本底值之和。

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3.3 标样测定结果

	峰面积（mV*sec）
	标1	标2	标3	标4	标5
苯	12	86	163.5	239	313
甲苯	0	69.5	141.5	212.5	282.5
乙苯	0	66.5	136.5	205	272
对二甲苯	0	67.5	137.5	207.5	275.5
间二甲苯	0	68	140	211.5	280.5
邻二甲苯	0	67.5	139	211.5	281
苯乙烯	0	63	129	195.5	260
注：峰面积均为2次测定结果平均值

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3.4 工作曲线
线性相关系数均大于0.999，方程截距均很小，可忽略不计。后续计算均按强制过原点拟合的结果。

	回归方程（线性拟合）	斜率（强制过原点拟合）	相关系数（强制过原点拟合）
苯	y = 2.3489x - 3.3942	2.315	0.9994
甲苯	y = 2.3137x - 2.654	2.285	0.9994
乙苯	y = 2.1971x - 2.6744	2.169	0.9993
对二甲苯	y = 2.2383x - 2.7966	2.208	0.9993
间二甲苯	y = 2.2735x - 3.1378	2.240	0.9991
邻二甲苯	y = 2.2896x - 3.6311	2.250	0.9988
苯乙烯	y = 2.2306x - 3.0658	2.196	0.9990
注：按线性拟合所得方程截距均很小，可忽略不计，因此试样测定结果的计算均按强制过原点拟合的结果。

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3.5 试样测定结果
测定值处于工作曲线中段，5次测定结果重现性在2%左右。

	峰面积（mV*sec）						浓度（mg/L）	RSD%
	1	2	3	4	5	平均	浓度（mg/L）	RSD%
苯	154	156	156	161	154	156.2	67.5	1.8
甲苯	153	154	155	159	153	154.8	67.7	1.6
乙苯	151	155	155	160	153	154.8	71.4	2.2
对二甲苯	149	153	153	157	151	152.6	69.1	1.9
间二甲苯	144	148	148	152	146	147.6	65.9	2.0
邻二甲苯	149	156	156	158	153	154.4	68.6	2.3
苯乙烯	145	149	148	152	145	147.8	67.3	2.0

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4、讨论
4.1 仪器
本次测试用的仪器：山东瑞虹SP7820，售价大约是3万多，应该算是国产气相色谱里面中低端产品的代表，我估计历次的草根比对中，没有那个实验室比我用的仪器更加草根的了。

这台仪器特点归纳起来大约是：价格便宜、性能一般，凑合能用。这也是国产仪器大部分的共性。这样的仪器很难简单的用好与不好来评价。如果维护得当，用得爱惜，在加上合理的改造和开发，很多时候还是能够做出有用的数据的。比如这次测试里面，我做了三点改造，气路面板右下角的几个窟窿就是改造气路后留下的，具体改造如下：
（1）载气换成氢气，分析时间缩短；
（2）FID喷嘴换成石英的，二硫化碳吸附拖尾的问题减小了；
（3）在填充柱气路系统中增加了氮气尾吹，保证了在使用氢气做载气是灵敏度不损失。
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至于测试的效果，至少在这个项目中，应该不会比安捷伦的仪器差多少的。倒不是说这台仪器有多好，也不是说安捷伦的不好，而是这个项目的测试要求其实很低，安捷伦的优势，例如超高惰性、超低流失、保留时间锁定、EPC高精度等都没有得到体现。进口仪器能够体现优势的地方只在自动进样器的重现性好方面。而手动进样的重现性不好也是可以通过进样方法的优化得以克服的，这在后面将讨论。
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但是国产仪器的通病在使用过程中也是很头疼的事，比如控温稳定性不好、后开门开合不到位报错、进样隔垫流失造成鬼峰、隔垫气密性不好、电网供电波动容易造成信号杂波、等。这些问题虽小，确是影响国产仪器用户体验的罪魁祸首。目前国产仪器的参数一个比一个高，招标时甚至能压倒一些进口仪器，但是这类的小问题缺难以解决，导致的结果就是仪器买来只能跑参数，实际用的时候就漏洞百出，用户体验不好，口碑也越来越差，不知道生产厂家什么时候能够重视这些问题。本次实验过程中还有一个插曲，做完色谱条件探索的实验之后发现石英喷嘴碎掉了，只能关机换喷嘴，所以条件实验的保留时间和后面进行定量分析时得到的保留时间是有差异的。
目前看来，安捷伦在技术上是成功的，在营销宣传上更是成功的，一般政府部门和大厂买仪器几乎都不考虑国产的。这不能简单的说是歧视国产仪器的问题，也不是财大气粗或者浪费国家经费，很重要的一点是因为安捷伦的色谱用起来省心、放心，而国产的色谱大部分确实费心、伤心。长期这样下去，就只有我这样的穷地方经费不足才会买国产色谱，国产色谱也就永远没法摘掉低端落后的帽子。
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4.2 色谱柱
在这个毛细管柱已经成为主流的时代，填充柱可谓“烈士暮年壮心不已”，有些地方填充柱仍然具有一定的优势。例如气体分析方面仍以填充柱为主，PLOT柱性能优势不显著，而成本明显劣势。在针对某些特殊物质时，填充柱可以通过固定相的搭配实现高选择性，而毛细管柱则没有这么灵活。本次测试对象中二甲苯异构体就是一个经典的例子，DNP-有机皂土混合固定相的选择性目前还很少有其他单一固定相能够超越。另外还有一个经典的例子就是DNP-吐温混合固定相的白酒分析柱，目前仍在广泛使用。
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本次测试使用的是我自己制备的3米填充柱，连铭牌都没有，看起来比较寒酸。

样品实测，总柱效可达5000塔板，邻间对异构体的分离度都在1.5以上，乙苯与对二甲苯分离度稍低，但也达到1.43，均不低于毛细管柱。因此用于7种苯系物的检测是完全可以达到分离要求的。但需要指出的是，在本次使用的色谱柱中DNP与有机皂土的相对比例为5:7，从而使二甲苯异构体的选择性较好，但是异丙苯与邻二甲苯的分离度有显著损失。所以此色谱柱在不含异丙苯的时候才适用，若同时还要测定异丙苯，DNP与有机皂土的相对比例应改为1:1，此时异丙苯能够分离，但二甲苯异构体的分离度有所降低。
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针对该色谱柱优化了实验条件，主要是载气流速和柱温。如前所述，载气改为氢气，适宜的流速比氮气更大，分析速度加快。而且氢气的范迪姆特曲线较为平坦，高速下柱效损失不显著。本色谱柱内径2mm，在15~30mL/min的载气流速范围内柱效和分离度变化不大。若为了进行高速分离而将流速提高到40mL/min，将损失一定的分离度，但也是在可以接受的范围内的。
载气流速40mL/min的色谱图如下：

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本次测定选择的柱温为80℃恒温。若将柱温提高到100℃，分析速度也显著加快，目标物分离度不低于1.1，也基本可以达到要求。但是柱温高时溶剂峰与苯分离不太好，低浓度时会影响定量。
柱温100℃的色谱图如下：

用程序升温可以使溶剂峰与苯分离更完全，并且可以使峰更加尖锐从而进一步提高分离度，但是填充柱在程序升温时基线漂移较为明显，总的分析时间也更长。
程序升温的色谱图如下，条件为60℃保持3min，3℃/min升温至90℃：

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使用填充柱最大的一个优势是进样量大、不分流，所以重现性很好，即使手动进样，RSD%做到3%以下也是很容易的。而毛细管柱分流进样，如果没有自动进样器，要达到这个精密度是很难的。五次进样的色谱图如下：

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4.3 气路
气路上折腾的比较多，基本上都重新接了一遍，跟出厂相比变化很大。上个图，不过基本上没法看清楚的。

FID使用时需要氢气、氮气、空气三者比例接近1:1:10才能获得最佳的灵敏度，一般设置是氢气40mL/min、氮气（载气+尾吹）30~40mL/min，空气400mL/min。通常填充柱使用氮气为载气，流量10~60mL/min不等，并不完全能够符合最佳比例。毛细管柱载气流量很小，一般靠增加尾吹气实现最佳流量比。在填充柱系统里面却很少考虑最佳流量比的问题，一般没有尾吹气。
本次测定中，载气为氢气，流量为25mL/min，为了获得最佳流量比例，将燃气气路的氢气流量减小到15mL/min，并且为填充柱系统增加一路氮气作为补充气，流量为40mL/min。之所以称作补充气而不是尾吹气，是因为这里的氮气并没有经过尾吹的三通接头进入，而是直接与氢气混合后进入FID。
其实从广泛意义来讲，不管是毛细管柱系统还是填充柱系统，补充气的叫法更加符合实际情况。因为传统教材里面讲的“尾吹气可以帮助试样更快进入检测器从而减小峰宽”的说法其实是错误的。了解FID结构就知道，毛细管柱是插入喷嘴里面的，即使没有插入里面也伸到了喷嘴的底端，而氢气的入口是低于柱出口的。因此，即使没有氮气作为尾吹，氢气也起到了尾吹的作用，可以使流出色谱柱的试样快速进入喷嘴。
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4.4 标样
按严格要求，正式的测定需要购买有证标样，从而保证结果的溯源性。直接购买也是最为简便的解决方式。但是正所谓“钱能解决的问题都不是问题，没有钱是最大的问题”，我们这种穷实验室一般是买不起现成标样的。但是这并不意味着我们的数据就不可靠。从实用意义上考虑，在气相色谱分析中，经验证纯度在99%以上且不含干扰性杂质的试剂是可以作为标样使用的。虽然这样会造成一定的误差，但相对仪器本身的不确定度来说，试剂纯度引起的误差其实要小得多。我这次作为标样使用的试剂见下图：

上述试剂出厂的质量标准均标称纯度不低于99%或99.5%，经气相色谱归一化方法检验确实符合质量标准。其中甲苯是管制品，买不到分析纯的，我是用工业级甲苯蒸馏制得的纯度99%以上的试剂。
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标样的配置采用重量-容量法。我这的容量瓶只有100mL的，直接定容配成100mL标液显然太浪费了，所以我采用的是吸取一定量标样称重，然后加入一定体积溶剂的做法，按溶液体积=溶质体积+溶剂体积来计算。虽然不同有机物混合时体积不完全符合加和性，但是由于浓度很低，这种误差实际上是可以忽略的。虽然穷，但关键地方不能省钱，用的量具还拿得出手：

标准系列也是类似的方法配置的，所以才会出现前面表里面那些不是整数的数值。虽然看起来不舒服，但实际测量和计算没什么影响。
标样和试样都装在安捷伦的小瓶子里面，这是本次使用的最贵的耗材，平时我都舍不得用安捷伦原装的。来个合影：

做出来的曲线有3个9以上，基本上是满意的。
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关于标样的配置，还有一个很头疼的事，就是空白值的问题。我买到的色谱纯的二硫化碳里面也含有不少苯，查到有专门的低苯级的二硫化碳，实在是太贵了。好在穷人有穷办法，我用标准加入法测定了二硫化碳里面苯含量的本底值，标样的浓度实际上是配置值与本底值之和。溶剂二硫化碳的色谱图如下：

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5 后记
金庸先生笔下，独孤前辈武功已入化境，草木皆为剑，无剑胜有剑。本文取“草木皆为剑”为题，绝非自夸技艺，更不是有独孤前辈的豪气，只是想表明，工具趁手合用即可，不在乎高档与低端。目前样品的标准值一直未给出，但比对结果判定为优秀，想必实测数据应该偏差不多，本文的初衷应该是完全达到了的。
这个简单的后记，拖了许久才写，究其原因是，原本是想讨论一下国产仪器优劣问题的，但是考虑再三，感觉涉及的问题太多，已经远超出了本文的初衷，所以还是决定不写了。至于本文提到的仪器品牌，这仅仅作为一个个案，不具备任何普遍意义，切勿任意引申。

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